脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成規(guī)律及酸敏感離子通道在脊髓損傷中的作用與機制研究.pdf

1、隨著國家經(jīng)濟的發(fā)展，交通、建筑及礦難等事故中導(dǎo)致的脊髓損傷(spinalcordinjury，SCI)己成為威脅人們健康的重要因素，關(guān)于SCI的研究因而備受國內(nèi)學(xué)者的高度關(guān)注。遺憾的是，迄今為止尚無有效治療SCI的方法和藥物，促使人們重新審視SCI的病理生理過程和致病機制。SCI后主要經(jīng)歷急性期和慢性期兩大病理生理階段，急性期病變主要以原發(fā)損傷啟動的一系列繼發(fā)損傷為主，導(dǎo)致?lián)p傷范圍的擴大和損傷程度的加重，所以，研究SCI急性期繼發(fā)損傷的

2、機制，如何盡可能地保護原發(fā)損傷周圍的正常脊髓免受繼發(fā)損傷的波及，是SCI治療的首要策略。 膠質(zhì)瘢痕和囊腔的形成是SCI慢性期的重要病理變化，是導(dǎo)致SCI后神經(jīng)再生修復(fù)失敗的重要原因，研究發(fā)現(xiàn)即便通過神經(jīng)移植橋接了囊腔壞死區(qū)，但移植物和神經(jīng)纖維仍無法穿越致密的膠質(zhì)瘢痕。因此，減少或去除膠質(zhì)瘢痕是一項有希望的慢性期SCI治療策略，但是有兩條重要的因素決定著這一策略的效果： 第一是瘢痕分布的特點如何?去除瘢痕的厚度應(yīng)該是多少?

3、囊腔周圍的瘢痕厚度是否一致?如果去除瘢痕過多，會損及正常脊髓組織造成新的損傷。 第二是去除膠質(zhì)瘢痕的時間窗應(yīng)如何選擇?過早或過晚可能都存在問題。所以，本研究將動態(tài)觀察膠質(zhì)瘢痕形成過程、瘢痕的厚度及其與神經(jīng)纖維的關(guān)系，為以上問題的回答提供實驗依據(jù)。 目的： 1.動態(tài)觀察SCI后膠質(zhì)瘢痕形成規(guī)律及其與神經(jīng)纖維的關(guān)系，并定量測量膠質(zhì)瘢痕的厚度。 2.觀察ASIC1a在SCI后的表達變化特點，研究ASIC1a在S

4、CI繼發(fā)損傷中的作用及可能的分子機制 方法： 1.采用大鼠脊髓挫傷模型，應(yīng)用組織病理學(xué)、行為學(xué)評分、誘發(fā)電位、免疫熒光技術(shù)及神經(jīng)束路示蹤等方法，觀察SCI后組織病理變化過程、軸突再生與膠質(zhì)瘢痕形成規(guī)律及相互關(guān)系，并測量瘢痕厚度。 2.應(yīng)用westernblotting、免疫熒光及激光共聚焦顯微鏡、RT-PCR等方法多側(cè)面觀察SCI后ASIC1a表達變化規(guī)律，及其變化意義。 3.利用體內(nèi)、外損傷模型，使用T

5、UNEL染色、電生理膜片鉗記錄、鈣成像、鞘內(nèi)置管給藥、反義核酸等技術(shù)探討ASIC1a在SCI繼發(fā)損傷中的作用及其可能機制。 結(jié)果： 1.本研究首先制作了4種不同致傷級別的脊髓挫傷模型，應(yīng)用組織病理學(xué)、行為功能評分、誘發(fā)電位、免疫熒光技術(shù)及神經(jīng)束路示蹤等方法，觀察比較它們的病理學(xué)變化，神經(jīng)功能恢復(fù)情況等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10g×50mm致傷組損傷很重，動物功能恢復(fù)較困難，10g×5mm致傷組則損傷太輕，動物基本可自行恢復(fù)到接近正常

6、功能，10g×25mm致傷組功能恢復(fù)曲線顯示早期與10g×50mm組類似，后肢癱瘓，后期類似10g×10mm致傷組。 2.本實驗發(fā)現(xiàn)SCI后動物運動功能顯著下降，以后逐漸恢復(fù)并在SCI后4w(week)左右恢復(fù)達平臺。與之相應(yīng)，神經(jīng)電生理檢查顯示運動/感覺誘發(fā)電位的潛伏期在傷后明顯延長，以后逐漸恢復(fù)，亦在SCI后4w相對穩(wěn)定。 3.應(yīng)用神經(jīng)束路示蹤、免疫熒光雙標(biāo)等方法觀察發(fā)現(xiàn)，SCI后神經(jīng)纖維具有一定的再生能力，大部分走

7、行于膠質(zhì)瘢痕外，未見穿透瘢痕區(qū)達到囊腔邊緣或穿透囊腔者，但也有部分軸突伸入到瘢痕外側(cè)部一定的深度，提示膠質(zhì)瘢痕是軸突再生之屏障。為將來瘢痕的去除提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，本研究尚測量了SCI后4w時膠質(zhì)瘢痕的厚度，結(jié)果顯示囊腔頭尾側(cè)瘢痕厚度與雙側(cè)壁厚度有一定差別，頭尾側(cè)厚度為107.00±20.12μm，雙側(cè)邊瘢痕厚度為69.92±15.12μm。 4.Westernblotting和免疫熒光觀察顯示SCI后損傷周圍區(qū)ASIC1a表達顯著

8、上調(diào)，在灰、白質(zhì)均升高，并在12-24h達高峰，然后逐漸回降，在SCI后1w左右基本恢復(fù)到原先水平，連續(xù)觀察6w未見有變化。與此不同，SCI后損傷區(qū)ASIC1a的表達則下降，SCI后1w左右即檢測不到，應(yīng)用Nissl及NeuN染色發(fā)現(xiàn)損傷區(qū)神經(jīng)元丟失嚴(yán)重，可能與損傷區(qū)ASIC1a表達下降有關(guān)。免疫熒光雙標(biāo)顯示灰質(zhì)中主要為神經(jīng)元表達ASIC1a，白質(zhì)中則是少突膠質(zhì)細胞表達ASIC1a。有趣的是，Westernblotting觀察發(fā)現(xiàn)正常脊

9、髓ASIC2a表達水平很低，但SCI后損傷區(qū)與損傷周圍區(qū)的表達均明顯上升，尤其損傷周圍區(qū)ASIC2a的表達升高持續(xù)到SCI后4w左右才恢復(fù)至原來水平。同樣可能由于細胞的死亡，損傷區(qū)ASIC2a的表達早期升高后在24h后迅速下降，直至檢測不到。RT-PCR結(jié)果提示SCI后ASIC1amRNA未見明顯變化，而ASIC2amRNA水平明顯升高。 5.應(yīng)用TUNEL標(biāo)記方法，發(fā)現(xiàn)TUNEL陽性細胞大多ASIC1a陽性，提示ASIC1a可

10、能參與了SCI后延遲性細胞死亡的發(fā)生。相反，TUNEL陽性細胞則基本上未見ASIC2a陽性，一方面提示ASIC2a可能沒有參與SCI后繼發(fā)的細胞死亡，另一方面反過來說明ASIC1a與TUNEL的共標(biāo)是特異的。進一步，利用體內(nèi)、外損傷模型，結(jié)合TUNEL、PI/FDA染色等方法，發(fā)現(xiàn)分別給予ASIC1a的特異性阻斷劑PcTx1和非特異性阻斷劑Amiloride均可降低損傷后細胞死亡。ASIC1a特異的反義核酸knockdownASIC1a

11、的表達也可以達到同樣的保護效果。 6.應(yīng)用電生理膜片鉗記錄與Ca2+成像技術(shù)，發(fā)現(xiàn)酸(pH6.0)刺激下可誘發(fā)脊髓神經(jīng)元一較大的內(nèi)向電流(酸電流)，亦可引起胞內(nèi)Ca2+濃度迅速的增加，此電流和Ca2+內(nèi)流可被ASIC1a通道特異性阻斷劑阻斷。在模擬的SCI后繼發(fā)的缺血缺氧病理條件下，ASIC1a介導(dǎo)的酸電流和Ca2+內(nèi)流均出現(xiàn)增強效應(yīng)。 7.進一步的實驗顯示病理條件下ASIC1a通道功能的增強可能和其磷酸化有關(guān)，Co-I

12、P實驗確實發(fā)現(xiàn)SCI后ASIC1a磷酸化水平顯著升高，而鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)可能參與了這一過程。Westernblotting結(jié)果顯示SCI后CaMKⅡ的表達顯著升高，其表達變化的時空特點和ASIC1a具有良好的相關(guān)性，應(yīng)用CaMKⅡ的特異性抑制劑KN93可顯著抑制缺血缺氧誘發(fā)的ASIC1a介導(dǎo)的酸電流和Ca2+內(nèi)流的增強效應(yīng)，并減輕細胞損傷。 8.最后，為在整體水平驗證ASIC1a在SCI中的作用，應(yīng)用鞘內(nèi)

13、置管技術(shù)，分別給予SCI大鼠ASIC1a的特異性阻斷劑PcTx1和非特異性阻斷劑Amiloride，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者均可減輕組織損傷，促進動物運動功能的恢復(fù)。ASIC1a特異的反義核酸亦具有類似的保護效果。 結(jié)論： 1.本研究所采用的SCI模型不僅能夠?qū)⒉煌墑e損傷區(qū)分開，且與動物行為學(xué)、電生理學(xué)和組織病理學(xué)變化想吻合。故本研究采用的模型具有較好的客觀性、穩(wěn)定性、相關(guān)性和重復(fù)性。 2.10g×10mm致傷組動物自發(fā)功

14、能恢復(fù)曲線穩(wěn)定、獨特，與其它不同級別的損傷區(qū)別明顯，可較客觀地反映不同SCI治療措施和藥物的療效，故本研究采用此致傷級別。 3.綜合行為學(xué)、電生理學(xué)、病理學(xué)及膠質(zhì)瘢痕形成觀察等多方面的證據(jù)提示大鼠SCI后4w左右進入慢性期，為人們認(rèn)識和研究慢性SCI提供了重要的實驗依據(jù)。 4.SCI后神經(jīng)纖維具有一定的再生能力，但很少能穿透膠質(zhì)瘢痕，說明膠質(zhì)瘢痕是阻擋軸突延伸的重要因素，提示去除膠質(zhì)瘢痕可能是治療SCI的重要策略，本研究

15、測量了瘢痕的厚度，為將來去除瘢痕提供了重要的時空參考數(shù)據(jù)。 5.SCI后ASIC1a表達上調(diào)明顯，且在灰、白質(zhì)均升高，在12-24h達高峰，SCI后1w左右回降到原先水平。免疫雙標(biāo)鑒定白質(zhì)中表達ASIC1a的細胞類型是少突膠質(zhì)細胞。ASIC1a表達的上調(diào)可能與其轉(zhuǎn)錄水平無關(guān)，而與翻譯和/或代謝有關(guān)。 6.體內(nèi)外實驗均表明ASIC1a確實參與了SCI后的繼發(fā)性損傷，其可能過程為：SCI后出現(xiàn)的組織酸化可激活A(yù)SIC1a通道

16、，引起一、二價陽離子的內(nèi)流，尤其是Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+蓄積，導(dǎo)致細胞損傷，SCI后ASIC1a表達的升高加劇了這一損傷過程。 7.在SCI后繼發(fā)的缺血缺氧病理條件下ASIC1a通道功能出現(xiàn)增強效應(yīng)，此效應(yīng)可能與鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)介導(dǎo)的ASIC1a的磷酸化水平升高有關(guān)。而CaMKⅡ的激活可能與ASIC1a通道介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流有關(guān)。 8.本研究顯示SCI后的組織酸化及其激活的ASIC1a通道

17、是SCI后繼發(fā)損傷的新的致病機制，為將來設(shè)計以ASIC1a為干預(yù)靶點的、特異的SCI治療新藥物，提供了重要的實驗依據(jù)。 綜上所述，組織酸化及ASIC1a通道在SCI的繼發(fā)損傷中起了重要作用，其可能機制是：SCI后組織酸化并伴隨ASIC1a表達增多，H+激活A(yù)SIC1a通道，引起Ca2+內(nèi)流，組織酸化持續(xù)存在導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+的蓄積，激活CaMKⅡ，然后CaMKⅡ反作用于ASIC1a，增加其磷酸化，引起ASIC1a通道功能增強，通C