姜黃素抑制脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成的機(jī)制及其對神經(jīng)再生的影響.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)引起的神經(jīng)功能缺失和缺乏有效的治療手段，一直是對人類健康的極大挑戰(zhàn)。脊髓損傷后，膠質(zhì)瘢痕修復(fù)損傷部位，但過度增生的瘢痕組織被認(rèn)為是阻礙軸突再生的重要原因，且與炎癥細(xì)胞的激活以及抑制性細(xì)胞外基質(zhì)的分泌密切相關(guān)。星形膠質(zhì)細(xì)胞受到炎癥因子激活后形成反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生并導(dǎo)致膠質(zhì)瘢痕的形成，膠質(zhì)瘢痕又可以分泌炎癥因子和細(xì)胞外抑制性基質(zhì)成分，加重了繼發(fā)性損傷，導(dǎo)致惡性循環(huán)。因此，抑制膠質(zhì)瘢痕的

2、形成是提高脊髓損傷神經(jīng)功能恢復(fù)的重要策略。
　　取自姜科姜黃屬多年生草本植物姜黃干燥梗莖中的姜黃素(curcumin，cur)，作為香料和食用色素很早就得到了廣泛應(yīng)用。大量的研究證實(shí)，姜黃素能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、趨化因子、炎癥因子和酶等發(fā)揮抗炎、抗纖維化、抗腫瘤等生物學(xué)功能。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制膠質(zhì)瘢痕的形成，但其作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)仍需要進(jìn)一步探討。
　　炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致繼發(fā)性脊髓損傷的重要因素。小膠質(zhì)細(xì)胞

3、作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)常駐免疫細(xì)胞，在脊髓損傷后迅速激活并持續(xù)分泌促炎因子，是介導(dǎo)脊髓損傷后炎癥反應(yīng)的重要成分。抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可以顯著提高實(shí)驗(yàn)動物脊髓損傷后運(yùn)動功能的恢復(fù)。姜黃素能抑制顱腦損傷后的小膠質(zhì)細(xì)胞的活性，但其在脊髓損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用缺乏深入的研究。炎癥反應(yīng)還和神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem/progenitor cells，NSPCs)的增殖與分化密切相關(guān)。抑制炎癥反應(yīng)可以促進(jìn)NSPCs分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞

4、。
　　基于以上理論，我們進(jìn)行了如下假設(shè):姜黃素能抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，脊髓損傷后其發(fā)揮強(qiáng)大的抗炎作用，有助于脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)?？刂萍顾钃p傷的炎癥反應(yīng)能改善NSPCs生長的環(huán)境，這對NSPCs分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞具有積極作用。本課題從以下幾個方面進(jìn)行了研究。
　　一.姜黃素抑制脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成
　　目的：
　　脊髓損傷能激活膠質(zhì)細(xì)胞并使其腫脹、增殖，形成反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生，

5、嚴(yán)重壓縮了神經(jīng)生長的空間。膠質(zhì)細(xì)胞還會分泌大量抑制性細(xì)胞外基質(zhì)，改變軸突生長的微環(huán)境。這些共同作為膠質(zhì)瘢痕的抑制因素，嚴(yán)重阻礙了神經(jīng)再生。本研究通過建立脊髓損傷模型后給予姜黃素干預(yù)，檢測其對膠質(zhì)瘢痕的作用。
　　方法:
　　1.采用SD大鼠建立脊髓夾傷模型，給予不同濃度姜黃素(300mg/kg、100 mg/kg、30 mg/kg)連續(xù)干預(yù)7天，并以甲基強(qiáng)的松龍作為對照;
　　2.在損傷8周后，采用BBB評分、斜板實(shí)驗(yàn)

6、和BDA染色評估神經(jīng)功能恢復(fù)情況;
　　3.在損傷8周后，通過HE染色和MRI檢測不同干預(yù)條件下脊髓空洞體積;
　　4.在損傷2周后，采用免疫組織化學(xué)染色觀察了膠質(zhì)瘢痕細(xì)胞內(nèi)外成分膠原纖維酸性蛋白(GFAP)和硫酸軟骨蛋白多糖(CSPG)表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.姜黃素處理組中BBB評分、斜板實(shí)驗(yàn)和BDA染色均優(yōu)于對照組，并且隨著濃度增加效果增強(qiáng)，姜黃素300mg/kg實(shí)驗(yàn)組效率最好;
　　2.姜黃素

7、能顯著抑制脊髓損傷8周后膠質(zhì)瘢痕形成;
　　3.姜黃素能抑制膠質(zhì)瘢痕細(xì)胞內(nèi)GFAP和細(xì)胞外CSPG成分;
　　4.姜黃素能抑制膠質(zhì)瘢痕中炎癥因子表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　姜黃素能促進(jìn)脊髓損傷后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。姜黃素通過抗炎作用抑制膠質(zhì)瘢痕細(xì)胞內(nèi)成分GFAP表達(dá)。姜黃素通過抑制轉(zhuǎn)錄因子減少膠質(zhì)瘢痕細(xì)胞外成分CSPG表達(dá)。聯(lián)合抑制細(xì)胞內(nèi)外成分是姜黃素發(fā)揮抑制膠質(zhì)瘢痕形成的作用機(jī)制。
　　二.姜黃素對星形膠質(zhì)細(xì)胞

8、的作用及機(jī)制
　　目的:
　　通過在體和離體實(shí)驗(yàn)，探討姜黃素干預(yù)下星形膠質(zhì)細(xì)胞在炎癥反應(yīng)與纖維化過程中表型的轉(zhuǎn)變以及其與膠質(zhì)瘢痕細(xì)胞內(nèi)外成分GFAP和CSPG表達(dá)的相互關(guān)系。
　　方法:
　　1.使用SD大鼠建立脊髓損傷模型并給予300 mg/kg姜黃素連續(xù)干預(yù)7天，采用姜黃素溶劑DMSO作為對照;
　　2.通過體外培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，并使用siRNA干擾NF-κb亞基p65和SOX9基因，采用EMSA、

9、WB和PCR檢測干擾效率;
　　3.使用免疫熒光、WB和PCR檢測膠質(zhì)瘢痕細(xì)胞內(nèi)成分GFAP表達(dá)和NF-κb信號通路的相互關(guān)系，ELISA檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞中趨化因子表達(dá)情況，流式細(xì)胞技術(shù)檢測膠質(zhì)瘢痕中T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量。
　　結(jié)果:
　　1.姜黃素能抑制NF-κb信號通路成分p-IKK-α、p-IKK-β、p-IκB-α和p65表達(dá)，上調(diào)NF-κb抑制性分子IκB-α表達(dá)，從而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化;
　　

10、2.姜黃素能通過調(diào)控NF-κb信號通路抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放趨化因子MCP-1、RANTES和CXCL10，
　　3.姜黃素能通過調(diào)控NF-κb信號通路減少膠質(zhì)瘢痕中T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤。
　　結(jié)論:
　　姜黃素通過干預(yù)NF-κb信號通路抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性，抑制其分泌趨化因子，從而減少膠質(zhì)瘢痕中巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞浸潤，減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。姜黃素通過調(diào)控SOX9信號通路抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞纖維化，減少細(xì)胞

11、外基質(zhì)成分CSPG沉積。姜黃素能通過聯(lián)合發(fā)揮抗炎抗纖維化作用，有效抑制脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕細(xì)胞內(nèi)外成分，有利于脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)。
　　三.姜黃素對小膠質(zhì)細(xì)胞的作用及機(jī)制
　　目的:
　　本研究使用核因子E2-轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子-2(Nrf2)基因敲除小鼠Nrf2(-/-)和野生型小鼠Nrf2(+/+)，建立脊髓損傷模型或LPS誘導(dǎo)原代小膠質(zhì)細(xì)胞，并給予不同濃度姜黃素干預(yù)后，探討了姜黃素在脊髓損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用及

12、其機(jī)制。
　　方法:
　　1.使用Nrf2(+/+)和Nrf2(-/-)小鼠，建立脊髓損傷模型，給予不同濃度姜黃素(100mg/kg，50mg/kg，25mg/kg)連續(xù)干預(yù)7天;
　　2.采用WB檢測脊髓損傷后28天內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活性與Nrf2表達(dá)之間的關(guān)系;
　　3.體外培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細(xì)胞，LPS刺激后給予姜黃素或ERK抑制劑U0126干預(yù)。
　　結(jié)果:
　　1.脊髓損傷后Nrf2和iNOS表達(dá)即可

13、升高，并于傷后第7天時達(dá)到峰值;
　　2.在體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素干預(yù)后能促使小膠質(zhì)細(xì)胞中Nrf2由胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)到胞核中，抑制iNOS表達(dá)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活性，且存在濃度依賴性，Nrf2基因敲除后廢除了姜黃素對小膠質(zhì)細(xì)胞的抑制作用;
　　3.離體實(shí)驗(yàn)顯示，姜黃素干預(yù)Nrf2(+/+)小膠質(zhì)細(xì)胞后，p-ERK和iNOS表達(dá)均下降，而Nrf2(-/-)小膠質(zhì)細(xì)胞中p-ERK表達(dá)沒有改變。
　　結(jié)論:
　　姜黃素抑制脊髓損傷后小

14、膠質(zhì)細(xì)胞的活性，通過減輕小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。姜黃素抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活是通過調(diào)控Nrf2/ERK/p65通路實(shí)現(xiàn)的。
　　四.控制炎癥反應(yīng)后對神經(jīng)干細(xì)胞再生的影響及機(jī)制
　　目的:
　　神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem/progenitor cells，NSPCs)具有自我增值及分化為中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞的潛能，是神經(jīng)損傷后細(xì)胞替代療法的重要細(xì)胞來源。如何誘導(dǎo)NSPCs定向分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)

15、胞，是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，也是熱點(diǎn)之一。本研究中我們通過體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞并誘導(dǎo)其分化為M1型和M2型，而后觀察各細(xì)胞上清誘導(dǎo)NSPCs分化情況，闡述不同表型的小膠質(zhì)細(xì)胞在NSPCs分化中的作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞，給予不同干預(yù)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，采用免疫熒光、WB和PCR檢測M1和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)情況;
　　2.收集不同表型小膠質(zhì)細(xì)胞上清制成NSPCs誘導(dǎo)分化培養(yǎng)

16、基并誘導(dǎo)NSPCs分化，采用免疫熒光和WB檢測神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化比例;
　　3.采用液相色譜一質(zhì)譜分析和ELISA實(shí)驗(yàn)檢測M2型小膠質(zhì)細(xì)胞PPARγ和15d-PGJ2表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.LPS+IFN-γ誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型，IL-4誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型;
　　2.M2型小膠質(zhì)細(xì)胞上清誘導(dǎo)NSPCs分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的比例升高，分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例減

17、少;
　　3.M2型小膠質(zhì)細(xì)胞中PPARγ和15d-PGJ2表達(dá)與M0和M1型相比較顯著升高。
　　結(jié)論:
　　M2型小膠質(zhì)細(xì)胞可以增加NSPCs分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的比例，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞分化數(shù)量。M2型小膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)NSPCs分化是通過激活PPARγ/β-catenin信號通路實(shí)現(xiàn)的。
　　綜上結(jié)果表明，姜黃素能抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，同時還能抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞纖維化。姜黃素通過聯(lián)合發(fā)