脊髓康干預(yù)Nogo-NgR信號(hào)通路調(diào)節(jié)脊髓損傷后神經(jīng)再生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后神經(jīng)再生困難是世界性難題，目前認(rèn)為主要與中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境內(nèi)抑制性因素相關(guān)。Nogo蛋白、髓磷脂相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glycoprotein，MAG)和少突膠質(zhì)細(xì)胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocytemyelin glycoprotein，OMgp)目前被認(rèn)為是影響脊髓損傷修復(fù)的髓磷脂抑制因子，三者均可與Nogo受體(nogo

2、 receptor，NgR)結(jié)合，能抑制成熟中樞神經(jīng)元軸突再生及誘導(dǎo)生長(zhǎng)錐潰變，從而達(dá)到抑制脊髓損傷修復(fù)。其中，Nogo蛋白抑制作用最為明顯，針對(duì)Nogo-NgR通路在脊髓損傷修復(fù)中作用機(jī)制探討已成為目前國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。
　　中藥“脊髓康”作為我們臨床經(jīng)驗(yàn)方，前期研究發(fā)現(xiàn)具有鎮(zhèn)痛、抗炎、促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)等作用。然而，“脊髓康”促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)的作用機(jī)制尚不清楚。為此，本研究通過(guò)制備大鼠脊髓損傷模型，觀察脊髓損傷后脊髓組織中No

3、go-NgR通路的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，探討“脊髓康”能否通過(guò)干預(yù)Nogo-NgR信號(hào)通路改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境以促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)再生。
　　目的：
　　按照改良Allen's法制備脊髓損傷模型，觀察大鼠脊髓損傷后脊髓組織中Nogo、NgR的免疫組化、Western blottingting及熒光定量PCR的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況，探討Nogo-NgR信號(hào)通路在神經(jīng)再生過(guò)程中的作用和意義;觀察中藥“脊髓康”對(duì)大鼠脊髓損傷后脊髓組織病理組織結(jié)

4、構(gòu)、細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白（growth associatedprotein-43，GAP-43）及Nogo-A、NgR的影響，探討其促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)再生的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1、將108只SD大鼠隨機(jī)分成正常組（N組）、假手術(shù)組（A組）和模型組（B組），每組36只。N組不做任何處理，A組咬除T10棘突及椎板，避免損傷脊髓，B組按照改良Allen's法造模，分別于干預(yù)后24h、3d、7d、14d處死大鼠，每組9只，

5、以免疫組化及Western blottingting檢測(cè)各組大鼠脊髓組織中Nogo-A、NgR蛋白的表達(dá)變化，以熒光定量PCR檢測(cè)Nogo-A、NgR mRNA的表達(dá)變化。
　　2、將180只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(A)、模型組(B)、強(qiáng)的松組(C)、脊髓康高劑量組(D)、脊髓康中劑量組(E)、脊髓康低劑量組(F)，每組30只。B、C、D、E、F組均按照改良Allen's法制備脊髓損傷模型，麻醉蘇醒后C組大鼠灌胃給藥強(qiáng)的松0.0

6、6g/(kg.d)，D組給藥“脊髓康”50g/(kg.d)，E組給藥“脊髓康”25g/(kg.d)，F(xiàn)組給藥“脊髓康”12.5g/(kg.d)，A組和B組均給予同等劑量的生理鹽水灌胃。觀察各組大鼠在3d、7d、14d時(shí)間點(diǎn)HE染色、透視電鏡、細(xì)胞凋亡、GAP-43蛋白、Nogo-A、NgR蛋白及mRNA的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1、Nogo-NgR信號(hào)通路在大鼠脊髓損傷組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及意義
　　免疫組化、West

7、ern blottingting及熒光定量PCR顯示，與假手術(shù)組比較，SCI后24h模型組Nogo-A、NgR蛋白和mRNA表達(dá)較低，3d后下降至最低，7d后迅速上升達(dá)到高峰，至14d逐漸下降，但仍高于假手術(shù)組。
　　2、“脊髓康”對(duì)大鼠脊髓損傷后組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響
　　HE染色顯示，SCI后3d模型組出現(xiàn)明顯脊髓組織結(jié)構(gòu)破壞，神經(jīng)元固縮、壞死，7d時(shí)脊髓組織結(jié)構(gòu)進(jìn)一步破壞，并可見(jiàn)膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)，14d時(shí)脊髓組織膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較

8、7d增多，并見(jiàn)較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。而強(qiáng)的松組及脊髓康高、中、低組在各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織結(jié)構(gòu)損傷均較模型組輕微，尤以強(qiáng)的松組和脊髓康中劑量組明顯。
　　透視電鏡顯示，SCI后3d模型組出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞膜破裂，線粒體腫脹明顯，染色質(zhì)邊集及核碎裂，髓鞘結(jié)構(gòu)紊亂，7d時(shí)損傷呈進(jìn)行性加重。而強(qiáng)的松組及脊髓康高、中、低組在各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織結(jié)構(gòu)損傷均較模型組輕微，尤以強(qiáng)的松組和脊髓康中劑量組明顯。
　　3、“脊髓康”對(duì)大鼠脊髓損傷后細(xì)胞凋亡及GA

9、P-43蛋白的影響
　　細(xì)胞凋亡免疫組化顯示，SCI后各時(shí)間點(diǎn)，模型組凋亡細(xì)胞數(shù)均為最多(P＜0.01)。術(shù)后3d時(shí)強(qiáng)的松組凋亡細(xì)胞數(shù)最少(P＜0.05)，術(shù)后7d時(shí)強(qiáng)的松組與高劑量組療效優(yōu)于其余各組，術(shù)后14d時(shí)強(qiáng)的松組與中劑量組療效較優(yōu)。
　　GAP-43蛋白免疫組化顯示，脊髓損傷各組在各時(shí)間點(diǎn)GAP-43蛋白表達(dá)均出現(xiàn)不同程度增高，且均在7d時(shí)達(dá)到最高(P＜0.05)。在3d、7d、14d各時(shí)間點(diǎn)，強(qiáng)的松組和中劑量組G

10、AP-43蛋白表達(dá)均明顯高于模型組(P＜0.01)。在7d、14d時(shí)，脊髓康高、低劑量組GAP-43蛋白表達(dá)亦明顯高于模型組(P＜0.05)
　　4、中藥“脊髓康”調(diào)節(jié)Nogo-NgR信號(hào)通路的機(jī)制研究
　　免疫組化、Western blottingting及熒光定量PCR顯示，大鼠SCI后3d時(shí)模型組、強(qiáng)的松組及脊髓康高、中、低各組Nogo-A、NgR蛋白及mRNA表達(dá)量較低，7d時(shí)表達(dá)量明顯增高，14d時(shí)出現(xiàn)不同程度下降

11、。與模型組比較，SCI后3d、7d、14d時(shí)強(qiáng)的松組和脊髓康中劑量組Nogo-A、NgR蛋白及mRNA表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.大鼠SCI后，Nogo-A、NgR蛋白在早期一過(guò)性下降后均在7d時(shí)上升達(dá)到最高峰，并可持續(xù)保持高水平表達(dá)，可能是造成脊髓損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)再生困難的重要原因之一。
　　2.“脊髓康”可減少SCI后細(xì)胞凋亡，維持髓鞘板層結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，上調(diào)GAP-43蛋白的