條件性損傷對脊髓損傷后再生的作用及其機(jī)制的初步探討.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分 條件性損傷在脊髓損傷后再生中的作用 目的：利用示蹤技術(shù)，觀察條件性損傷(坐骨神經(jīng)損傷或者腰5運(yùn)動根損傷)對脊髓背索損傷后薄束、楔束再生的影響。 方法：成年健康雌性SD大鼠，隨機(jī)分為正常組、單純脊髓損傷組(脊髓背索損傷)和合并損傷組(條件性損傷1周后行脊髓背索損傷)。脊髓背索損傷后，動物存活2周。在脊髓背索損傷同時，于脊髓損傷區(qū)頭側(cè)端5mm處注射快藍(lán)(Fast blue，F(xiàn)B)逆行示蹤

2、背根節(jié)感覺神經(jīng)元，動物處死前3天于坐骨神經(jīng)注射霍亂毒素亞單位B(Cholera Toxin B Subunit，CTB)順行示蹤脊髓上行感覺束，觀察脊髓損傷后薄束、楔束的再生情況。 結(jié)果：正常大鼠薄束核和楔束核可見CTB陽性纖維；單純脊髓損傷組薄束核和楔束核則未發(fā)現(xiàn)CTB陽性纖維，CTB陽性纖維終止于脊髓損傷區(qū)尾側(cè)端，形成膨大樣結(jié)構(gòu)，沒有進(jìn)入膠質(zhì)瘢痕；合并損傷組，可見CTB標(biāo)記的上行感覺束纖維，穿過脊髓損傷區(qū)進(jìn)入損傷區(qū)頭側(cè)端，膠

3、質(zhì)瘢痕中CTB陽性纖維數(shù)目較單純脊髓損傷組多。FB逆行示蹤顯示，合并損傷組背根節(jié)中FB標(biāo)記的感覺神經(jīng)元數(shù)目較單純脊髓損傷組多。 結(jié)論：條件性損傷能促進(jìn)脊髓背索損傷后薄束、楔束的再生。 第二部分 條件性損傷促進(jìn)脊髓損傷后再生的作用機(jī)制 目的：觀察條件性損傷后脊髓和背根節(jié)中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophin factor，BDNF)的表達(dá)情況及中和了內(nèi)源性BDNF后條件性損傷對脊

4、髓再生的影響，探討條件性損傷在脊髓損傷后再生中的作用機(jī)制。 方法：成年健康雌性SD大鼠，隨機(jī)分為正常組、單純條件性損傷組、單純脊髓損傷組和合并損傷組，合并損傷組動物腹腔給予BDNF抗血清或正常羊血清(NSS)，術(shù)后動物存活1天、7天或14天。采用免疫組織化學(xué)、原位雜交和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)方法檢測BDNF在損傷脊髓局部、脊髓腰骶膨大部及雙側(cè)L4、L5背根節(jié)中的表達(dá)，并結(jié)合FB逆行示蹤觀察FB陽性神經(jīng)元BDNF的表達(dá)情況

5、。用FB逆行示蹤背根節(jié)感覺神經(jīng)元和CTB順行標(biāo)記上行感覺束，觀察BDNF抗血清處理后脊髓再生的情況。條件性損傷1周后，取背根節(jié)神經(jīng)元和背根節(jié)組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過βⅢ-tubulin免疫熒光染色觀察BDNF抗血清處理后背根節(jié)神經(jīng)元突起的生長情況。 結(jié)果：單純條件性損傷組，損傷側(cè)的脊髓腰骶膨大部、背根節(jié)中BDNF蛋白及mRNA表達(dá)均上調(diào)。與單純脊髓損傷組相比，合并損傷組在脊髓損傷的尾側(cè)端可見較多的BDNF陽性纖維，這些纖維呈膨體樣

6、結(jié)構(gòu)，主要分布于損傷脊髓尾側(cè)端的白質(zhì)里，合并損傷組FB標(biāo)記的感覺神經(jīng)元數(shù)目也較單純脊髓損傷組多，且大部分FB標(biāo)記的感覺神經(jīng)元是BDNF陽性的神經(jīng)元。中和內(nèi)源性BDNF后，合并損傷組脊髓CTB標(biāo)記的纖維終止于脊髓空洞前，僅有極少數(shù)纖維長入損傷區(qū)。通過測量由損傷區(qū)尾側(cè)端長入損傷區(qū)的再生軸突長度發(fā)現(xiàn)，BDNF抗血清處理組再生軸突的長度明顯短于NSS處理組，同時，背根節(jié)中FB標(biāo)記的感覺神經(jīng)元數(shù)目也顯著少于NSS處理組。背根節(jié)神經(jīng)元體外培養(yǎng)和Ma

7、trigel里培養(yǎng)背根節(jié)組織顯示，BDNF抗血清處理后，背根節(jié)神經(jīng)元和背根節(jié)組織神經(jīng)突起的長度較NSS組明顯縮短。 結(jié)論：條件性損傷促進(jìn)脊髓損傷后的軸突再生機(jī)制可能與脊髓和背根節(jié)中BDNF的表達(dá)增加有關(guān)。 第三部分 BDNF參與條件性損傷促進(jìn)脊髓損傷再生作用的可能機(jī)制 目的：通過觀察條件性損傷或合并損傷結(jié)合BDNF抗血清處理后，脊髓和背根節(jié)中生長相關(guān)蛋白-43(growth associated protein-

8、43，GAP-43)、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase，p-Erk)和RhoA的表達(dá)變化，探討B(tài)DNF參與條件性損傷促進(jìn)脊髓損傷再生作用的可能機(jī)制。 方法：成年健康雌性SD大鼠，隨機(jī)分為正常組、單純條件性損傷組、單純脊髓損傷組和合并損傷組，單純條件性損傷組和合并損傷組動物術(shù)后給予BDNF抗血清或NSS處理，大鼠存活3天、7天或14天

9、。用免疫組織化學(xué)方法、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶pull down(GST-pull down)及蛋白質(zhì)免疫印跡等，檢測單純條件性損傷組背根節(jié)中GAP-43和p-Erk的表達(dá)，單純脊髓損傷組和合并損傷組脊髓損傷局部GAP-43和RhoA的表達(dá)情況，及BDNF抗血清處理后，上述指標(biāo)的表達(dá)變化情況。 結(jié)果：與正常對照相比，單純條件性損傷后1周，背根節(jié)中GAP-43和p-Erk陽性的感覺神經(jīng)元數(shù)目顯著上調(diào)，BDNF抗血清處理后，GAP-43陽性和

10、p-Erk陽性的感覺神經(jīng)元比例下調(diào)。脊髓損傷后3天，單純脊髓損傷組GAP-43和RhoA表達(dá)上調(diào)，7天達(dá)到高峰，并持續(xù)到損傷后14天。合并損傷組GAP-43的表達(dá)明顯上調(diào)，較單純脊髓損傷組高，但RhoA表達(dá)下調(diào)。BDNF抗血清處理后，合并損傷組脊髓損傷局部GAP-43的表達(dá)較NSS組下調(diào)，RhoA表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論：在條件性損傷促進(jìn)脊髓損傷后再生過程中，BDNF可能通過上調(diào)GAP-43的表達(dá)，激活p-Erk信號通路及下調(diào)RhoA發(fā)