siRNA作用于Vimentin抑制大鼠脊髓傷后膠質瘢痕形成的研究.pdf

1、【目的】
　　設計篩選siRNA干擾中間絲波形蛋白（Vimentin）序列，觀察siRNA-Vimentin對脊髓損傷后反應性星形膠質細胞膠質纖維酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein，GFAP）和硫酸軟骨素蛋白多糖（Chondroitin Sulfate Proteoglycans，CSPG）表達的影響，分析其對脊髓損傷大鼠后肢運動功能和神經(jīng)電生理功能恢復的作用，及其對脊髓組織GFAP、CSPG

2、和Vimentin的表達及膠質瘢痕形成的影響。探討siRNA作用于Vimentin在脊髓損傷后反應性星形膠質細胞增生和膠質瘢痕形成過程中所起的作用。
　　【方法】
　　設計3條Vimentin干擾序列，并利用Western Blot及RT-PCR篩選出沉默效果相對較好的序列；初生SD乳鼠分離培養(yǎng)皮質星形膠質細胞，并經(jīng)差速貼壁等方法純化，GFAP免疫化學熒光鑒定獲得星形膠質細胞。將細胞分為正常培養(yǎng)AS組、空載質粒處理陰性對照組

3、和siRNA-Vimentin轉染組，進行細胞劃痕實驗、MTT法測定各組細胞增殖能力，免疫熒光化學染色及RT-PCR驗證siRNA作用于Vimentin對脊髓損傷后反應性星形膠質細胞增生及膠質瘢痕形成的影響及GFAP、CSPG和Vimentin之間的相互作用。同時，采用改良Allen垂直打擊法制備SD大鼠脊髓胸10（T10）脊髓損傷動物模型，并將實驗動物隨機分為三組：假手術組（30只）、陰性對照組（30只）和siRNA-Vimentin

4、組（30只），于造模同時假手術組注射DMEM/F12培養(yǎng)基5μl，陰性對照組注射DMEM/F12培養(yǎng)基+空載質粒5μl，siRNA-Vimentin組注射DMEM/F12培養(yǎng)基+siRNA-Vimentin質粒5μl。分別于術后24h、1w、2w、4w、8w和12w進行BBB評分，并于術后24h和12w進行SEP、MEP測定；術后4w取各組脊髓組織進行RT-PCR測定GFAP、CSPGs和Vimentin表達情況；術后12w取各組脊髓組

5、織計算各組膠質瘢痕體積。收集以上各數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。
　　【結果】
　　設計篩選的3條siRNA干擾序列中，siRNA-Vimentin-1073相對沉默效果最好，轉染效率最高為轉染后24h，細胞轉染效率＞80％；原代分離培養(yǎng)的SD大鼠皮質星形膠質細胞純化后，經(jīng)GFAP胞漿免疫熒光染色及DAPI細胞核染色，隨機選取6個視野觀察，GFAP陽性細胞百分比約為（96.14±1.03）%；星形膠質細胞劃痕實驗，siRNA-Vimi

6、ntin組2d/0d寬度比為（0.74±0.17），數(shù)值明顯為高（P<0.05），與MTT結果共同提示siRNA作用于Vimintin對反應性膠質細胞增生有抑制作用；各組細胞免疫熒光染色積分光密度（IOD）和Western Blot檢測siRNA-Vimintin轉染星形膠質細胞后GFAP、CSPG及Vimentin的表達同時下調，與正常培養(yǎng)星形膠質細胞組和空載質粒陰性對照比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；術后8w、12w siR

7、NA-Vimentin組BBB評分提高較為明顯（P<0.05）；術后12w，siRNA-Vimentin組 SEP、MEP與其他各組比較改善較為明顯（P<0.05）；術后12w，損傷早期局部注射siRNA-Vimentin的脊髓損傷大鼠模型組，膠質瘢痕體積較對照組明顯較小（P<0.05）。術后4w各組RT-PCR檢測結果顯示，siRNA-Vimentin組脊髓組織中GFAP、CSPG和Vimentin表達均顯著下調。
　　【結論】