神經(jīng)細(xì)胞粘附分子（NCAM）在氟致原代培養(yǎng)大鼠海馬細(xì)胞毒效應(yīng)中的作用.pdf

1、地方性氟中毒是一種嚴(yán)重危害人體健康的全身性疾病。流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)，氟可影響兒童智力發(fā)育，損害學(xué)習(xí)記憶能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，海馬是氟神經(jīng)毒作用的靶部位。近年來(lái)細(xì)胞凋亡在氟毒性機(jī)制中的作用已引起關(guān)注，人們已從多方面探討了氟誘導(dǎo)凋亡機(jī)制，自由基損傷是其中之一，但氟對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激和凋亡的影響報(bào)道較少。 突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶獲得、鞏固和保持的基礎(chǔ)。而在突觸形成及其可塑性的調(diào)節(jié)中，神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(neuralcelladhesio

2、nmolecules，NCAM)起著極為關(guān)鍵的作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中存在三種主要的受發(fā)育調(diào)控的NCAM亞型：NCAM-180、NCAM-140和NCAM-120，是同一基因隨機(jī)剪切的結(jié)果。NCAM主要通過(guò)同源性和異源性作用介導(dǎo)細(xì)胞的黏附，激活跨膜信息傳導(dǎo)，影響細(xì)胞遷移、樹(shù)突延伸及突觸的形成，在神經(jīng)發(fā)育及學(xué)習(xí)記憶形成、鞏固和再生等重大腦功能中起著重要的作用。因此，我們?cè)O(shè)想氟可能通過(guò)影響海馬組織NCAM的表達(dá)而產(chǎn)生以學(xué)習(xí)記憶損害為主的神經(jīng)毒作用

3、。 本次研究以大鼠海馬細(xì)胞為研究對(duì)象，用低劑量氟24h染毒后，觀察氟對(duì)海馬細(xì)胞氧化應(yīng)激、DNA損傷和凋亡以及NCAMmRNA和蛋白表達(dá)水平的影響，初步揭示細(xì)胞調(diào)亡和NCAM在氟致神經(jīng)毒性機(jī)制中的作用。氟的神經(jīng)毒理研究以大鼠原代海馬細(xì)胞為模型以及氟是否對(duì)NCAM表達(dá)產(chǎn)生影響是本次研究的新穎之處。 本研究主要由以下三部分組成： 第一部分：原代大鼠海馬細(xì)胞培養(yǎng)方法的建立和染毒劑量的確定 目的：建立原代大鼠海馬細(xì)

4、胞培養(yǎng)方法，探討氟對(duì)大鼠海馬細(xì)胞存活率的影響，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)的氟染毒劑量。 方法：原代培養(yǎng)的大鼠海馬細(xì)胞分別用預(yù)設(shè)濃度20、40、80、160μg/ml氟化鈉染毒24h，觀察不同劑量氟作用后海馬細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞存活情況；用MTT法測(cè)定海馬細(xì)胞存活率。 結(jié)果：20、40μg/ml染毒劑量組與對(duì)照組相比，其形態(tài)學(xué)改變無(wú)明顯差異，80、160μg/ml染毒劑量組神經(jīng)元突起減少、變短，160μg/ml染毒劑量組可見(jiàn)細(xì)胞崩解。80

5、、160μg/ml染毒劑量組與對(duì)照組細(xì)胞存活率相比有顯著性下降(P＜0.05)，160μg/ml劑量組細(xì)胞存活率＜50％，其他染毒劑量組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論：氟可抑制原代培養(yǎng)海馬細(xì)胞的存活，高濃度的氟可抑制神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)，提出氟對(duì)發(fā)育中海馬細(xì)胞損傷可能是其神經(jīng)毒性的作用位點(diǎn)之一。確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)的氟染毒劑量為20、40、80μg/ml。 第二部分：氟對(duì)原代培養(yǎng)大鼠海馬細(xì)胞氧化應(yīng)激、DNA損傷和凋亡的

6、影響 目的：利用體外實(shí)驗(yàn)方法探討氟對(duì)海馬細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響以及對(duì)原代培養(yǎng)大鼠海馬細(xì)胞DNA損傷和凋亡的影響。 方法：原代培養(yǎng)海馬細(xì)胞暴露于20、40、80μg/ml氟化鈉24h后，分別檢測(cè)海馬細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)ROS水平，SOD、GSH-Px活力，GSH、MDA含量，細(xì)胞釋放LDH活性，DNA損傷以及凋亡的情況。 結(jié)果：40、80μg/ml劑量組海馬細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)ROS水平、MDA含量、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞外LDH活性皆明顯高于

7、對(duì)照組(P＜0.05)，各劑量組GSH、GSH-Px均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，80μg/ml劑量組SOD活性顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，各劑量組彗星Olive尾矩顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。同一劑量組細(xì)胞內(nèi)ROS水平與細(xì)胞凋亡率有明顯正相關(guān)關(guān)系(r=0.913，P＜0.05)。 結(jié)論：氟可引起大鼠海馬細(xì)胞細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致海馬細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激、DNA損傷和凋亡，活性氧可能在氟誘導(dǎo)的凋亡中起重要作用。 第三部

8、分：氟對(duì)原代大鼠海馬細(xì)胞NCAMmRNA和蛋白表達(dá)的影響 目的：在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，觀察氟對(duì)原代大鼠海馬細(xì)胞NCAM表達(dá)的影響，研究氟對(duì)NCAM表達(dá)的劑量-效應(yīng)關(guān)系。 方法：原代培養(yǎng)海馬細(xì)胞暴露于20、40、80μg/ml氟化鈉24h后，用RT-PCR和Westernblot方法分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NCAMmRNA和NCAM各蛋白亞型的表達(dá)。 結(jié)果：40、80μg/ml劑量組細(xì)胞NCAMmRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組