?；撬釋υ囵B(yǎng)大鼠肝細(xì)胞的毒性作用研究.pdf

1、目的：探索使用兩步灌流法分離培養(yǎng)原代正常大鼠肝細(xì)胞的條件和方法，研究?；撬釋υ囵B(yǎng)的正常大鼠肝細(xì)胞的毒性作用，以利用體外肝細(xì)胞模型建立藥物肝毒性評價(jià)體系進(jìn)行探索。 方法：(1)原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞使用經(jīng)典的“兩步門靜脈膠原酶灌注分離法”進(jìn)行分離，接種后貼壁培養(yǎng)，觀察記錄細(xì)胞生長狀況，觀察指標(biāo)包括：臺盼蘭拒染法測定細(xì)胞活率、繪制細(xì)胞生長曲線。(2)?；撬釋υ笫蟾渭?xì)胞毒性作用實(shí)驗(yàn)，包括直接加藥法：測定藥物的IC50，MTT比色實(shí)驗(yàn)測

2、藥物對細(xì)胞的生長抑制率，藥物作用24h后測定培養(yǎng)液上清的AST、ALT、LDH、GSH、細(xì)胞內(nèi)GSH的濃度，免疫組化TUNEL法測定細(xì)胞凋亡率(AI)；含藥血清法：MTT法測定含5％、10％、15％、20％含藥血清的培養(yǎng)液對細(xì)胞的生長抑制率的影響。(3)動物實(shí)驗(yàn)部分：牛磺酸靜脈大劑量注射對大鼠肝、脾臟器系數(shù)的影響、對肝脾的病理改變，血清中AST、ALT、LDH、GSH及10％肝勻漿GSH的含量影響。 結(jié)果：(1)兩步門靜脈膠原酶

3、灌注分離取得的肝細(xì)胞活率＞70％，24h內(nèi)貼壁，生長良好，從生長曲線可看出培養(yǎng)第3天進(jìn)入對數(shù)生長期；(2)直接加藥法測得?；撬酙C50為24.23mg/ml，MTT實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞生長抑制率與劑量有正相關(guān)性，TUNEL實(shí)驗(yàn)細(xì)胞凋亡率測定，3個(gè)給藥組AI分別為：3.71％、29.72％、42.56％。培養(yǎng)液上清AST、ALT顯著升高，LDH含量上升，培養(yǎng)液上清和細(xì)胞內(nèi)GSH含量均減少；含5％、10％、15％、20％含藥血清的培養(yǎng)液對細(xì)胞的生長抑

4、制率明顯比直接加藥法?。?3)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，動物肝、脾明顯腫大，但病理切片顯示肝脾結(jié)構(gòu)和細(xì)胞損傷小，血清AST、ALT含量無明顯變化，牛磺酸大劑量組血清LDH含量有顯著降低，血清GSH，細(xì)胞內(nèi)GSH含量略有降低，但無顯著差異。 結(jié)論：兩步門靜脈膠原酶灌注分離法是個(gè)產(chǎn)量高，損傷小，細(xì)胞純度高的分離原代正常大鼠肝細(xì)胞的方法；直接加藥法實(shí)驗(yàn)中高濃度的?；撬釋w外培養(yǎng)肝細(xì)胞有一定損傷，但血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中?；撬釋?xì)胞的損傷較直接加藥法??；動