柴胡皂苷a對谷氨酸激活體外培養(yǎng)大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞的干預(yù)作用.pdf

1、目的與意義： 癲癇是一種嚴重危害人類健康的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在我國癲癇的患病率為4.6‰。由于社會傳統(tǒng)的偏見，癲癇病人及家屬常隱瞞或否認自己的病情，并承受很大的心理壓力。由癲癇引起的醫(yī)療、家庭和社會問題極為顯著。 目前常用一線抗癲癇藥(AEDs)可使大部分癲癇患者發(fā)作得以控制，但長期應(yīng)用安全性較差，對于一些難治性癲癇行外科手術(shù)治療，也受到適應(yīng)癥的限制，風(fēng)險大，費用昂貴，還存在復(fù)發(fā)的可能。因此難治性癲癇仍然以藥物治療為主要手段

2、，這就需要使用新的抗癲癇藥，但其研究前提是對于癲癇發(fā)病機制的深入認識。 近年來癲癇的發(fā)病機制研究有了長足進步。神經(jīng)元興奮性增高和高度同步化發(fā)放是癲癇發(fā)病的兩個重要特征已得到公認，國內(nèi)外很多學(xué)者試圖從多個方面來探索引起神經(jīng)元興奮性增加和高度同步化發(fā)放的形成機制，提出了不少有益的見解。其中對星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)信號傳遞的認識逐步深入，位于突觸聯(lián)合處的星形膠質(zhì)細胞被認為是突觸三聯(lián)體的重要組成部分。谷氨酸(Glu)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要的

3、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，是重要的致癇原因，既可導(dǎo)致癲癇發(fā)作，又可能在癲癇的繼發(fā)性腦損害中起重要作用。正常情況下，神經(jīng)元將Glu釋放到突觸間隙，然后由星形膠質(zhì)細胞攝取后再轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，這種神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞間的谷氨酸.谷氨酰胺循環(huán)在正常神經(jīng)系統(tǒng)功能中起著重要作用，這種循環(huán)一旦遭破壞即可導(dǎo)致Glu在突觸間隙大量堆積，使神經(jīng)元處于高度興奮的狀態(tài)，從而致使驚厥形成。神經(jīng)系統(tǒng)損傷時，往往伴隨星形膠質(zhì)細胞的活化，又稱反應(yīng)性膠質(zhì)增生(Reactivegl

4、iosis)，首要特征是其重要的骨架蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達增加，激活的星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)突觸傳遞施加影響，可以通過多種途徑來作用于神經(jīng)元，增加神經(jīng)元興奮性，進而引起癲癇的發(fā)作。 柴胡皂苷a(SSa)為我國傳統(tǒng)中藥柴胡主要藥理成分柴胡皂苷的一種單體成分，柴胡皂甙具有公認的抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用，并且在我們前期的研究基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)柴胡總皂苷和SSa可以抗實驗性癲癇、抑制慢性點燃大鼠GFAP的表達，調(diào)節(jié)海馬Glu的表達，故我們推

5、測SSa可以通過抑制Glu對神經(jīng)系統(tǒng)作用和抑制其激活的星形膠質(zhì)細胞來發(fā)揮抗實驗性癲癇的作用。 而目前體外SSa抗癲癇機制研究尚不明確，本實驗由廣東省中管局課題基金(NO.1060133)資助研究了SSa對Glu激活體外培養(yǎng)大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞的干預(yù)作用，探討SSa可能的抗癲癇機制。 方法與內(nèi)容： 1.大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)與鑒定 星形膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)參考McCarthy法。取新生SD大鼠海馬，剪碎，

6、消化，離心，差速貼壁40min后，按106個/cm2接種。37.0℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)7-9d，待培養(yǎng)的細胞70％-80％融合時，將培養(yǎng)瓶置于恒溫旋轉(zhuǎn)搖床上搖18h(37.0℃，240r/min)后，進行傳代培養(yǎng)即得純化的星形膠質(zhì)細胞，純化的細胞進一步運用免疫細胞化學(xué)SABC法進行鑒定。 2.SSa對Glu激活體外培養(yǎng)的大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞活性的影響 運用MTT比色法檢測各組星形膠質(zhì)細胞活細胞數(shù)量。將傳代細胞按8×1

7、04個/cm2的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μl。完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，用含5％胎牛血清的培養(yǎng)基配制藥物干預(yù)組共6組：a組為正常組(control組)，b組為L-GIu(1.5mmol/L)的激活組，c組為L-Glu+SSa劑量組(分別為1.5mmol/L，10mg/L)，d組為含L-Glu+SSa劑量組(分別為1.5mmol/L，5mg/L)，e組為含L-Glu+SSa劑量組(分別為1.5mmol/L，2.5mg/L)，f組

8、為含L-Glu+SSa劑量組(分別為1.5mmol/L，1.25mg/L)。每組6孔，每孔加入200μl，繼續(xù)培養(yǎng)72h后運用MTT法測OD值，以O(shè)D值反映各組星形膠質(zhì)細胞活細胞數(shù)量。 3.SSa對Glu激活體外培養(yǎng)大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞分裂周期的影響 運用流式細胞技術(shù)檢測各組星形膠質(zhì)細胞的細胞周期。將傳代細胞以5×105個/cm2密度種植于直徑10mm的培養(yǎng)皿中。完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，用DMEM/F12培養(yǎng)基配制藥物干

9、預(yù)組共5組：a組為正常組(control組)，b組為L-Glu(1mmol/L)的激活組，c組為L-Glu+SSa劑量組(分別為1mmol/L，5mg/L)，d組為L-Glu+SSa劑量組(分別為1mmol/L，2.5mg/L)，e組為含L-Glu+SSa劑量組(分別為1mmol/L，1.25mg/L)。在加藥24h后取材，PI染色并調(diào)整細胞密度為106個/cm2，而后用流式細胞技術(shù)檢測各組星形膠質(zhì)細胞細胞周期，每組樣本檢測104個細胞

10、，以細胞指數(shù)表示分布于細胞周期各時相的細胞百分比數(shù)，以增殖指數(shù)反映細胞增殖狀態(tài)。 4.SSa對Glu激活體外培養(yǎng)大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞GFAP表達的影響 運用Western-blot法檢測各組星形膠質(zhì)細胞GFAP表達量。將傳代細胞以5×105個/ml的密度種植于培養(yǎng)皿中，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，用DMEM/F12培養(yǎng)基配制藥物干預(yù)組共5組：a組為正常組(control組)，b組為L-Glu(1.5mmol/L)的激活組，c

11、組為L-Glu+SSa劑量組(分別為1.5mmol/L，5mg/L)，d組為含L-Glu+SSa劑量組(分別為1.5mmol/L，2.5mg/L)，e組為含L-Glu+SSa劑量組(分別為1.5mmol/L，1.25mg/L)。作用24h后，提取蛋白，運用western-blot技術(shù)檢測GFAP表達的變化，對結(jié)果進行灰度分析，計算GFAP與β-actin的比值。每組蛋白檢測6次。 統(tǒng)計方法： 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件

12、進行處理。各組MTT比色法結(jié)果和western-blot檢測結(jié)果比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA)，進一步組間比較用LSD法；流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果比較采用R×C表資料的卡方檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1.星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)和鑒定 原代培養(yǎng)的大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞，鏡下觀察可見星形膠質(zhì)細胞生長較好，所有細胞均貼壁。原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞運用免疫組化染色法鑒定，細胞的GFAP免疫

13、反應(yīng)陽性率為98％以上。 2.Glu對體外培養(yǎng)大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞活性的影響及SSa的干預(yù)作用 體外培養(yǎng)大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞在不同處理因素處理下各組OD值，與a組比較，b組、c組、d組、f組OD值均高于a組，差異有顯著性意義(P<0.05)；與b組比較，a組、c組、d組、e組OD值均低于b組，而f組則高于b組，差異有顯著性意義(P<0.05)。結(jié)果提示：Glu可以顯著激活體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞，促進細胞增殖，而SSa對Gl

14、u激活的細胞增殖具有顯著抑制作用。 3.Glu對體外培養(yǎng)大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞分裂周期的影響及SSa的干預(yù)作用 各組流式細胞技術(shù)檢測的細胞周期結(jié)果：各組細胞增殖指數(shù)差異有顯著性意義(P<0.001)。各組細胞增殖指數(shù)均高于a組，各組細胞增殖指數(shù)均低于b組。結(jié)果提示：Glu(1mmol/L)可以顯著激活大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞，加速星形膠質(zhì)細胞的分裂周期。SSa對激活細胞的分裂周期均存在一定的阻滯作用。 4.Glu對體外

15、培養(yǎng)大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞GFAP表達的影響及SSa的干預(yù)作用 各組westem-blot檢測結(jié)果：GFAP表達量b組、c組、e組與a組比較差異均有顯著性意義(P<0.05)；a組、c組、d組GFAP表達量低于b組，差異有顯著性意義(P<0.05)，而e組高于b組，差異有顯著性意義(P<0.05)。提示：Glu可以顯著激活大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞，促使星形膠質(zhì)細胞GFAP過度表達，而SSa對其激活存在抑制作用。 結(jié)論：