絞股藍皂苷抗谷氨酸氧化性神經(jīng)損傷保護作用機制研究.pdf

1、在病理情況下，谷氨酸（Glutamate，Glu）在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的堆積或大量釋放是導致神經(jīng)細胞損傷和多種神經(jīng)退行性疾病的重要因素。Glu可以通過過度激活Glu受體產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性，其中NMDA受體的激活起著關(guān)鍵作用，還可以通過抑制神經(jīng)細胞膜上的谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運體產(chǎn)生氧化性神經(jīng)毒性。Glu這兩種損傷機制區(qū)別的關(guān)鍵在于Glu受體尤其是NMDA受體的發(fā)育情況，研究表明，體外培養(yǎng)的神經(jīng)元隨培養(yǎng)時間延長NMDA受體的表達有發(fā)育性變化，但目前對體

2、外原代培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)元NMDA受體發(fā)育性變化的報道仍很缺乏。絞股藍皂苷（Gypenosides，GPs）是從葫蘆科植物絞股藍中提取的主要有效成分，大量實驗表明GPs具有多種藥理功效。本課題組以往研究表明，GPs能夠顯著拮抗Glu誘導的氧化性神經(jīng)損傷，并對GPs的神經(jīng)保護機制進行了大量研究，但該作用的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制至今尚不完全清楚。 研究目的： 1.通過對神經(jīng)元NMDA受體主亞基NMDAR1（NR1）亞基的研究，

3、探討NMDA受體在體外原代培養(yǎng)的胎鼠大腦皮層神經(jīng)元的發(fā)育變化，為與NMDA受體有關(guān)的生理、病理研究提供實驗依據(jù)。2.通過對PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路在GPs拮抗Glu誘導胎鼠大腦皮層神經(jīng)元氧化性損傷中作用的研究，探討GPs拮抗Glu誘導的氧化性神經(jīng)損傷保護作用機制，為神經(jīng)退行性疾病的治療提供一定的理論依據(jù)。 實驗方法： 以體外原代培養(yǎng)的Wistar孕大鼠（孕14～15d）胚胎大腦皮層神經(jīng)元為實驗材料，實驗分兩部分進行。

4、 1.體外原代培養(yǎng)的胎鼠大腦皮層神經(jīng)元NMDAR1亞基的發(fā)育變化 1）倒置相差顯微鏡觀察：培養(yǎng)不同時間神經(jīng)元的形態(tài)變化； 2）免疫熒光染色：鑒定神經(jīng)元的純度和NR1亞基在神經(jīng)元上的定位； 3）流式細胞儀：檢測不同培養(yǎng)時間神經(jīng)元NR1亞基的平均熒光強度； 4）蛋白免疫印跡法（Western blot）：檢測不同培養(yǎng)時間神經(jīng)元NR1亞基的表達。 2.PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路在GPs拮抗Gl

5、u誘導胎鼠大腦皮層神經(jīng)元氧化性損傷中的作用 1）實驗分組：正常對照組，Glu損傷組，GPs預處理+Glu組，LY294002+GPs預處理+Glu組，LY294002組； 2）倒置相差顯微鏡觀察：觀察實驗各組神經(jīng)元形態(tài)變化； 3）MTT法：檢測實驗各組神經(jīng)元存活率變化； 4）Hoechst33342染色：觀察實驗各組神經(jīng)元核形態(tài)變化； 5）流式細胞儀：檢測各組神經(jīng)元凋亡率變化； 6）Wes

6、tern blot法：檢測磷酸化Akt和總Akt的表達。 實驗結(jié)果： 1.NMDAR1亞基的發(fā)育變化 1）神經(jīng)元純度鑒定：原代培養(yǎng)的胎鼠大腦皮層細胞在2、5、12d時神經(jīng)元的純度分別為94.1％±2.1％、92.5％±1.2％、90.8％±1.5％，神經(jīng)元純度均達到90％以上； 2）NR1亞基膜定位：NR1亞基主要分布在神經(jīng)元胞膜及樹突干膜上； 3）流式細胞儀檢測：培養(yǎng)1、2、3、4、6、9、12

7、d神經(jīng)元NR1亞基平均熒光強度分別為4.57±0.99、8.18±1.22、13.67±1.99、20.33±1.03、26.30±2.88、31.71±2.47、28.63±1.40； 4）Western blot檢測NR1亞基表達：膜蛋白NR1亞基在1～2d表達微弱，3～6d表達逐漸增高，6d以后保持穩(wěn)定。 2.PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路在GPs拮抗Glu誘導的胎鼠大腦皮層神經(jīng)元氧化性損傷中的作用 1）形態(tài)

8、學觀察：正常對照組神經(jīng)元胞體飽滿，立體感強，神經(jīng)元伸出長短不等的突起，建立起廣泛的突起聯(lián)系；Glu損傷組神經(jīng)元，大部分細胞突起回縮變短，胞體變圓或皺縮，細胞黏附力下降，部分細胞脫壁漂浮于培養(yǎng)液中；GPs+Glu組神經(jīng)元，細胞生長狀態(tài)較好，大部分神經(jīng)元都能保持胞體和突起的完整；LY+GPs+Glu組神經(jīng)元又可見大量細胞變圓或皺縮，突起回縮；LY組神經(jīng)元細胞生長狀態(tài)良好，接近正常組神經(jīng)元； 2）神經(jīng)元存活率的變化：GPs能顯著拮抗G

9、lu誘導的神經(jīng)元氧化性損傷（P<0.01），加入磷脂酰肌醇3位羥基激酶（PI3K）特異性抑制劑LY294002后，神經(jīng)元的相對存活率比GPs+Glu組顯著降低（P<0.01）； 3）神經(jīng)元核形態(tài)變化：正常對照組神經(jīng)元核呈現(xiàn)體積較大，彌散均勻，藍色淺染的正常核形態(tài)；Glu組神經(jīng)元出現(xiàn)許多核固縮，染色質(zhì)濃縮，藍色深染的凋亡核形態(tài)，并可見凋亡小體出現(xiàn)；GPs+Glu組神經(jīng)元少見核固縮，染色質(zhì)濃縮；LY+GPs+Glu組神經(jīng)元核又呈現(xiàn)較

10、多的凋亡核形態(tài)；LY組神經(jīng)元未見凋亡，和control組神經(jīng)元接近； 4）神經(jīng)元凋亡率的變化：GPs能顯著降低Glu引起的神經(jīng)元凋亡（P<0.01），加入PI3K的特異性抑制劑LY294002后，神經(jīng)元凋亡率比GPs+Glu組顯著增加（P<0.01）； 5）磷酸化Akt和總Akt表達變化：GPs能夠顯著增加磷酸化Akt的表達，增加為Glu損傷組的1.8倍（P<0.01），加入LY294002后，能夠顯著抑制由GPs引起的

11、磷酸化Akt表達的增加（P<0.01），各組間總Akt表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 實驗結(jié)論： 1.體外原代培養(yǎng)的胎鼠大腦皮層神經(jīng)元NR1亞基有發(fā)育性變化，1～2d表達微弱，3～6d表達逐漸增高，6d以后保持穩(wěn)定，這種變化與神經(jīng)元的成熟度有關(guān)； 2.NR1亞基作為NMDA受體的主亞基，其發(fā)育變化可以反映NMDA受體在體外培養(yǎng)神經(jīng)元的表達變化過程，為利用體外原代培養(yǎng)的胎鼠大腦皮層神經(jīng)元探討NMDA受體