絞股藍皂苷抗谷氨酸誘導的氧化性神經(jīng)毒性的機制研究.pdf

1、研究背景：谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，除能夠通過激活其離子型受體產(chǎn)生興奮性毒性外，還可通過抑制細胞膜上谷氨酸/胱氨酸逆轉(zhuǎn)運子的作用導致氧化性神經(jīng)毒性。缺血、腦卒中等急性神經(jīng)損傷及早老性癡呆(Alzheimer'sdisease)、帕金森氏癥(Parkinson's disease)等慢性神經(jīng)變性疾病都與谷氨酸的氧化性神經(jīng)毒性密切相關。絞股藍[Gynostemma Pentaphyllum(Thunb)Makino]系葫蘆科

2、絞股藍屬多年生草質(zhì)藤本植物，其主要有效成分為絞股藍皂苷(Gypenosides，GP)。目前己從其中分離鑒定出80余種皂苷，其中6種皂苷化學結構與人參皂苷結構相同。GP具有抗癌、抗衰老、降血脂、免疫調(diào)節(jié)及鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等多種藥理學作用。其中單體SH-6(原2α-羥基人參二醇皂苷)為人參二醇皂苷類，成分比較明確，其化學結構也已得到確認，動物實驗研究顯示能夠增強小鼠的學習記憶獲得過程。關于GP對神經(jīng)元損傷的保護作用已有初步研究，但從信號通路角度研

3、究其抗神經(jīng)氧化性損傷的作用機制仍鮮見報道。研究目的： 在課題組以往工作的基礎上，通過對GP抗谷氨酸誘導的氧化性神經(jīng)損傷信號通路的深入研究，進一步從細胞和分子水平對GP的保護作用機制進行探討，為分析谷氨酸在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用機制提供一定的理論依據(jù)，為神經(jīng)退行性疾病的治療提供新的思路，并為抗氧化性神經(jīng)損傷藥物的研發(fā)提供重要的實驗依據(jù)。實驗方法：以Wistar孕大鼠(13.5～14d)胚胎原代培養(yǎng)的大腦皮層神經(jīng)元為實驗材料，用含1

4、0％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5％CO<,2>、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。神經(jīng)細胞培養(yǎng)24 h后，進行藥物分組實驗。 1．細胞形態(tài)及MAP2免疫細胞化學染色觀察：適時將培養(yǎng)細胞置于倒置相差顯微鏡下進行形態(tài)觀察；用MAP2熒光抗體標記神經(jīng)元，DAPI復染的方法在熒光顯微鏡下觀察，顯微攝像系統(tǒng)采集圖像； 2．MTT法細胞活力檢測：MTT法進行GP抗谷氨酸氧化性神經(jīng)毒性的作用時間分析和MEKl(MAPKK)特異性阻

5、滯劑PD98059對GP保護作用的影響分析及絞股藍單體皂苷SH-6抗谷氨酸氧化性神經(jīng)損傷的作用濃度和作用時間分析； 3．生化指標檢測：生化檢測法測定細胞內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transfemse GSTs)的活力水平： 4．超微結構觀察：用透射電子顯微鏡對正常對照組、谷氨酸損傷組及GP保護組細胞進行超微結構的觀察； 5．流式細胞儀檢測：用流式細胞儀定量檢測正常對照組、谷氨酸損傷組和GP

6、保護組細胞內(nèi)ERKl/2的磷酸化水平； 6．實時定量RT-PCR法檢測：實時定量RT-PCR法分析正常對照組、谷氨酸損傷組、GP保護組及GP+PD98059+谷氨酸組神經(jīng)細胞立早基因c-fos mRNA的表達情況； 7．激光共聚焦顯微鏡檢測：用激光共聚焦顯微術檢測不同實驗組細胞內(nèi)細胞色素C的熒光強度及分布變化并進行圖像采集和分析； 通過以上實驗，對GP抗谷氨酸誘導的氧化性神經(jīng)損傷的信號轉(zhuǎn)導通路進行研究。

7、實驗結果： 1．細胞形態(tài)及MAP2免疫細胞化學染色觀察發(fā)現(xiàn)：剛接種的原代胎鼠大腦皮層神經(jīng)細胞呈單個圓形，均勻懸浮于培養(yǎng)液中。體外培養(yǎng)12h(DIVl2h)觀察可見絕大多數(shù)細胞已經(jīng)貼壁，分散均勻，胞體呈三角形或多角形，部分細胞伸出長短不等的突起，少數(shù)細胞之間已經(jīng)建立突起聯(lián)系：接種24h，胞體飽滿立體感增強，多數(shù)神經(jīng)細胞纖維輪廓清晰且伸展較長，細胞間已經(jīng)建立了緊密的突起聯(lián)系。谷氨酸作用12 h后，大部分細胞突起消失，胞體縮成圓形，立

8、體感差，可見大量細胞碎片。GP保護組細胞生長狀態(tài)良好，胞體飽滿立體感強，細胞間依舊保持良好的突起聯(lián)系，少見細胞皺縮破碎現(xiàn)象。細胞用MAP2抗體標記，DAPI復染后，在熒光顯微鏡下觀察結果顯示：MAP2陽性細胞占培養(yǎng)細胞的90％以上，表明所培養(yǎng)的細胞絕大部分為神經(jīng)元。 2．MTT法細胞活力檢測結果： (1)GP拮抗谷氨酸氧化性神經(jīng)毒性的作用時間分析表明：GP可明顯拮抗谷氨酸誘導的氧化性神經(jīng)毒性。GP200μg/ml于谷氨

9、酸損傷前作用12小時的保護效果明顯好于在谷氨酸損傷前作用2小時和損傷同時的保護作用，更好于損傷后的保護作用； (2)PD98059 50μM不會去除GP拮抗谷氨酸氧化性神經(jīng)損傷的保護效應，并可在一定程度上增強GP的保護作用； (3)SH-6抗谷氨酸氧化性神經(jīng)毒性的作用時間和作用濃度分析表明：不同濃度的絞股藍皂苷單體SH-6于谷氨酸作用前及同時加入對谷氨酸誘導的神經(jīng)氧化性損傷的保護作用均不明顯。SH-6在50、100、20

10、0、400μg/ml濃度時與谷氨酸損傷組細胞存活率無明顯差別。 3．生化指標的檢測結果表明：GP可明顯拮抗谷氨酸引起的神經(jīng)細胞中谷胱甘肽S一轉(zhuǎn)移酶(GSTs)的活力水平下降。 4．超微結構觀察發(fā)現(xiàn)：正常對照組神經(jīng)元形態(tài)較幼稚，核較大，細胞核與細胞質(zhì)電子密度相似，核中常染色質(zhì)豐富，呈顆粒狀分布，異染色質(zhì)少見，細胞突起較短：谷氨酸損傷組神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)溶酶體增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復合體數(shù)目減少：而GP保護組神經(jīng)元超微結構接近于正常

11、對照組，但比正常組更顯成熟，可見胞漿內(nèi)富含糖原和脂滴，細胞突起較長。 5．流式細胞術定量檢測結果發(fā)現(xiàn)：與正常對照組相比較，谷氨酸損傷組細胞內(nèi)磷酸化ERKl/2水平在谷氨酸作用后1h即明顯升高，損傷12h磷酸化ERKl/2水平下降，但仍略高于正常對照組：GP保護組細胞內(nèi)磷酸化ERKl/2始終處于稍高于正常對照組的水平。 6．實時定量RT-PCR法檢測表明：與正常對照組比較，谷氨酸損傷組立早基因c-los mRNA表達水平在

12、谷氨酸作用1h即明顯增強：GP保護組細胞中c-fosmRNA表達水平則明顯降低；GP+PD98059+谷氨酸組細胞內(nèi)c-fos mRNA表達水平接近于正常對照組。 7．激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)：正常對照組細胞細胞色素C熒光強度弱，呈顆粒狀集中在細胞核附近；谷氨酸損傷組熒光強度顯著增強，呈彌散分布；GP保護組細胞熒光強度減弱；GP+PD98059+谷氨酸組熒光強度辦減弱，接近于GP保護組。 實驗結論： 以體外原代培

13、養(yǎng)的胎鼠未成熟大腦皮層神經(jīng)元為實驗對象，以谷氨酸為工具藥，建立谷氨酸氧化性損傷模型，研究絞股藍皂苷抗谷氨酸誘導的氧化性神經(jīng)損傷的保護作用機制。結果發(fā)現(xiàn)： 1．在該實驗模型中，原代培養(yǎng)48h的胎鼠大腦皮層細胞中，神經(jīng)元占90％以上： 2．GP200μg/ml能明顯拮抗谷氨酸的氧化性神經(jīng)毒性，提高細胞的存活率，并于谷氨酸作用前12h加入達最佳保護效果(與實驗室以往結論一致)，另外，超微結構顯示GP對神經(jīng)細胞有明顯的促進生長發(fā)

14、育的作用； 3．絞股藍皂苷單體SH-6并不能拮抗谷氨酸導致的氧化性神經(jīng)損傷，提示絞股藍皂苷中另有其他活性成分在該保護效應中起作用； 4．GP不僅能通過提高GSTs酶的活力調(diào)節(jié)GSH的生成，抑制線粒體細胞色素C的釋放，來調(diào)節(jié)凋亡執(zhí)行者caspase家族成員的功能達到細胞保護的目的，而且還可能通過降低鈣內(nèi)流、減少ROS生成等環(huán)節(jié)作用于MAPK/ERK1/2信號轉(zhuǎn)導途徑，下調(diào)ERK1/2的磷酸化水平，從而抑制立早基因c．10s