β-細(xì)辛醚對(duì)谷氨酸所致神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)擬在體外培養(yǎng)PC12 細(xì)胞和原代培養(yǎng)乳鼠腦皮層神經(jīng)元的基礎(chǔ)上，探討β-細(xì)辛醚對(duì)興奮性氨基酸——谷氨酸損傷神經(jīng)元的干預(yù)作用，試圖通過本研究，能夠闡明體外谷氨酸興奮性損傷的作用機(jī)制及為開發(fā)抗興奮性氨基酸毒性新藥提供研究基礎(chǔ)。 研究目的： 1．觀察β-細(xì)辛醚對(duì)生理狀態(tài)下PC12細(xì)胞和大鼠腦皮層神經(jīng)元形態(tài)和細(xì)胞活力的影響，初步了解β-細(xì)辛醚對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的干預(yù)作用； 2．觀察β-細(xì)辛醚對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞及乳鼠腦

2、皮層神經(jīng)元的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)理。 研究方法： 1．提取并精制β-細(xì)辛醚； 2．觀察對(duì)其形態(tài)學(xué)和細(xì)胞活力的影響； 3．建立PC12細(xì)胞谷氨酸損傷模型； 4．體外培養(yǎng)PCI2細(xì)胞，β-細(xì)辛醚，探討β-細(xì)辛醚對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)損傷的PCI2細(xì)胞的干預(yù)作用； 5．體外培養(yǎng)大鼠腦皮層神經(jīng)元，培養(yǎng)至第10d，光學(xué)顯微鏡和免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定神經(jīng)元； 6．建立大鼠腦皮層神經(jīng)元谷氨酸損傷模型；

3、 7．觀察對(duì)其形態(tài)學(xué)和細(xì)胞活力的影響； 8．探討β-細(xì)辛醚對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)損傷的腦皮層神經(jīng)元的干預(yù)作用。 研究結(jié)果： 1．相差顯微鏡下PC12細(xì)胞呈現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)，胞體呈三角形、菱形、梭形，2-4 個(gè)突觸，相互交叉成網(wǎng)狀，折光性較強(qiáng)；透射電鏡下細(xì)胞核呈圓形，單個(gè)存在，染色質(zhì)分布均勻，核膜完整，細(xì)胞質(zhì)富含線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體，細(xì)胞膜完整，微絨毛豐富；也可見核膜消失，染色質(zhì)密集，成分葉狀，為處于分裂、增殖的PC

4、I2細(xì)胞； 2．PC12細(xì)胞與基質(zhì) A 組、基質(zhì)B組及36.014、72.028、144.057、288.114、576.228、1152.456、2304.912μmol/Lβ-細(xì)辛醚共培養(yǎng) 6h，基質(zhì)A組、基質(zhì)B組及36.014～576.228μmol/Lβ-細(xì)辛醚組細(xì)胞形態(tài)未有明顯改變，1152.456、2304.912μmol/Lβ-細(xì)辛醚組細(xì)胞的突起減少，細(xì)胞皺縮，折光性下降，部分細(xì)胞脫落；共培養(yǎng)24h，基質(zhì)A組、基質(zhì)

5、B組及36.014～288.114μmol/Lβ-細(xì)辛醚組PC12細(xì)胞形態(tài)未有明顯改變，576.228μmol/Lβ-細(xì)辛醚組PC12細(xì)胞已有損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞突起結(jié)構(gòu)消失減少、細(xì)胞圓縮聚集，1152.456、2304.912μmol/Lβ-細(xì)辛醚組PC12細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重； 3．10mmol/L的谷氨酸與PC12細(xì)胞共培養(yǎng)16h，相差顯微鏡下見細(xì)胞不同程度的變圓、皺縮，突觸縮短、減少，局部脫落、裂解成碎片；透射電鏡未見明顯凋亡

6、特征性改變，細(xì)胞核完整，染色質(zhì)減少、溶解消失，出現(xiàn)空隙，細(xì)胞質(zhì)疏松，線粒體腫脹、脫顆粒、嵴斷裂，空泡形成，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、形成空泡，溶酶體腫脹，細(xì)胞膜尚完整，微絨毛消失。10μmol/L 尼莫地平及36.014、72.028、144.057/μmol/Lβ-細(xì)辛醚預(yù)給藥4h，光鏡下尼莫地平組及β-細(xì)辛醚組細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，透射電鏡下可見尼莫地平組少量細(xì)胞線粒體略減少，溶酶體縮小，出現(xiàn)空隙，微絨毛減少等改變，也可見與正常培養(yǎng)PC12細(xì)胞結(jié)構(gòu)

7、無明顯差異的細(xì)胞；144.057/μmol/Lβ-細(xì)辛醚組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)無明顯改變； 4．10mmol/L的谷氨酸與PCI2 細(xì)胞共培養(yǎng)16h，細(xì)胞活力下降(0.88±0.05)，培養(yǎng)液中LDH含量增多((607.24±14.31)U/L)，細(xì)胞凋亡率增加(10.82％)，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高(189.29±19.72)，線粒體膜電位下降((66.88±4.70)％)； 5．相差顯微鏡下培養(yǎng)至10d的腦皮層神經(jīng)元胞體呈

8、錐形或多角形，突起主干和分支明顯延長(zhǎng)并增粗，有明顯的光暈，折光性增強(qiáng)，富有立體感，形成稠密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果顯示，大部分細(xì)胞可見神經(jīng)元烯醇酶免疫陽性顆粒位于核周質(zhì)及突起中(呈棕黃色)，細(xì)胞核不染色，為一圓形或橢圓形淡染區(qū)，膠質(zhì)纖維酸性蛋白 染色呈弱陽性；透射電鏡可見神經(jīng)元體積較大，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)均較大，呈淺灰色著色，染色質(zhì)分布均勻，核膜雙層結(jié)構(gòu)完整，線粒體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器較豐富； 6．培養(yǎng)至12～14d的腦

9、皮層神經(jīng)元與36.014、72.028、144.057、288.114、576.228、1152.456、2304.912μmol/Lβ-細(xì)辛醚共培養(yǎng)24h，與正常培養(yǎng)的神經(jīng)元比較，36.014～576.22μmol/Lβ-細(xì)辛醚組神經(jīng)元形態(tài)無明顯改變；而1152.456μmol/Lβ-細(xì)辛醚組神經(jīng)元胞體相對(duì)較大；2304.912μmol/lβ-細(xì)辛醚則對(duì)神經(jīng)元有損傷作用，神經(jīng)元變圓、皺縮，折光性下降，部分突起收縮； 7．培養(yǎng)至

10、12～14d的腦皮層神經(jīng)元與40mmol/L谷氨酸共培養(yǎng)16h后，折光性明顯下降，部分細(xì)胞變圓、皺縮、脫落，裂解成碎片，透射電鏡可見神經(jīng)元胞核呈圓形，核膜光滑、完整，染色質(zhì)邊聚，線粒體腫脹，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；10mol/L尼莫地平及36.014、72.028、144.057μmol/Lβ-細(xì)辛醚預(yù)給藥4h，能不同程度地減輕谷氨酸對(duì)腦皮層神經(jīng)元的損傷，光鏡下細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，透射電鏡下可見144.057μmol/Lβ-細(xì)辛醚組其神經(jīng)元除少

11、量染色質(zhì)邊聚、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微擴(kuò)張、線粒體輕度腫脹外，余與正常培養(yǎng)的腦皮層神經(jīng)元無明顯差異； 8．培養(yǎng)至12～14d的腦皮層神經(jīng)元與40mmol/L谷氨酸共培養(yǎng)16h后，其凋亡細(xì)胞增多 (21.05±4.81)％，培養(yǎng)液中 LDH 含量增高(619.40±36.71)U/L，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高(107.49±21.10)，線粒體膜電位輕微下降(91.93±8.54)％，但與正常對(duì)照組比較，未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；10μm

12、ol/L尼莫地平組及144.057、72.028、36.014μmol/Lβ-細(xì)辛醚組的細(xì)胞活力、培養(yǎng)液中LDH含量、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、線粒體膜電位分別為(0.66±0.01、0.63±0.01、0.58±0.01、0.56±0.01)、(440.80±27.28、475.00±33.51、561.64±39.36、593.56±41.50)U/L、(6.80±2.48、5.97±0.88、9.01±2.46、9.83±1.

13、92)％、(92.56±21.13、94.64±20.97、84.89±18.82、107.57±24.12)、(99.27±1.89、98.57±2.48、95.48±7.22、95.10±5.16)％。 研究結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)高分化PCI2細(xì)胞，接種在含5％胎牛血清、5％馬血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，2h后完全貼壁，細(xì)胞呈小三角形，12h呈現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)，胞體呈三角形、菱形、梭形，伸出2～4個(gè)突起，折光

14、性較強(qiáng)，24h后突起較長(zhǎng)，互相交叉，48h后細(xì)胞生長(zhǎng)呈網(wǎng)狀，符合神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，可用于實(shí)驗(yàn)； 2.基質(zhì)A、基質(zhì)B對(duì)正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及細(xì)胞活力無明顯影響，576.228、1152.456、2304.912μmol/L的β-細(xì)辛醚能抑制體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞增殖。關(guān)于β-細(xì)辛醚對(duì)體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞增殖的抑制作用是作用于增殖周期中的哪一個(gè)環(huán)節(jié)，并通過何種機(jī)制來實(shí)現(xiàn)，還需要進(jìn)一步研究； 3.谷氨酸對(duì)高分化P

15、C12細(xì)胞的毒性作用有明顯的劑量依賴關(guān)系，隨著谷氨酸濃度的增加，其毒性作用增強(qiáng)；10mmol/L谷氨酸與PC12細(xì)胞共培養(yǎng)16h，可造成PC12細(xì)胞凋亡模型； 4.36.014、72.028、144.057μmol/Lβ-細(xì)辛醚預(yù)給藥 4h，均能不同程度地減輕10mmol/L 谷氨酸對(duì) PC12 的損傷作用，抑制 LDH 漏出，拮抗細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的異常升高，穩(wěn)定MMP狀態(tài)，從而發(fā)揮其抗神經(jīng)元凋亡的作用； 5.本實(shí)驗(yàn)建立

16、的新生大鼠腦皮層神經(jīng)元培養(yǎng)方法，可得到純度較高的神經(jīng)元，為揭示神經(jīng)元、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)超微結(jié)構(gòu)及神經(jīng)元生理、生化和病理等方面的復(fù)雜變化和研究神經(jīng)藥理學(xué)提供了便利； 6.一定濃度的β-細(xì)辛醚對(duì)正常培養(yǎng)的大鼠腦皮層神經(jīng)元有促生長(zhǎng)作用，其神經(jīng)元胞體較大，突起密集； 7.谷氨酸對(duì)腦皮層神經(jīng)元的毒性作用有明顯的劑量依賴關(guān)系，隨著谷氨酸濃度的增加，其毒性作用增強(qiáng)；40mmol/L谷氨酸與腦皮層神經(jīng)元共培養(yǎng)16h，可造成神經(jīng)元凋亡模型；