栝樓桂枝湯對谷氨酸所致的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的:
　　觀察栝樓桂枝湯(GLGZD)對谷氨酸（Glutamic acid，Glu）誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞(PC12)損傷的保護(hù)作用的影響，并初步探討其作用機(jī)制，從而為其治療腦卒中提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.谷氨酸(Glu)對PC12細(xì)胞的損傷作用:體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。設(shè)立空白對照組和Glu損傷組（5、10、15、20、25mmol/L），處理24h，四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT

2、)法檢測細(xì)胞的增殖活性，確定最佳濃度。設(shè)立空白對照組和最佳Glu濃度組分別培養(yǎng)不同時(shí)間(1、2、4、6、8、10h)，MTT檢測細(xì)胞活性，最終確定Glu處理最佳的濃度和時(shí)間。光學(xué)顯微鏡觀察造模條件下細(xì)胞形態(tài)和甲瓚的遷移情況。
　　2.GLGZD對Glu誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用:MTT法測定GLGZD分別孵育PC1224、48 h對細(xì)胞活性的影響，確定GLGZD的培養(yǎng)時(shí)間;實(shí)驗(yàn)分為以下幾組:空白對照組，Glu模型組，GLGZ

3、D高、中、低劑量組。預(yù)先加入含1％FBS的1640培養(yǎng)基，GLGZD高、中、低劑量組培養(yǎng)24h后，加入終濃度為15mmol/L Glu繼續(xù)孵育6h。MTT法檢測PC12細(xì)胞生長和增殖活性;光學(xué)顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài);試劑盒測定LDH含量、SOD活性、MDA含量;AnnexinⅤ/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析細(xì)胞凋亡情況。
　　3.GLGZD對Glu誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷后細(xì)胞凋亡的影響:試劑盒測定Caspase-3活性;采用W

4、estern Blot檢測各組細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況;采用real-time PCR法檢測Bcl-2mRNA、Bax mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.用不同劑量的谷氨酸(5、10、15、20、25mmol/L)孵育PC12細(xì)胞24h后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率隨著濃度的增加逐漸下降，并且以15 mmol/L的Glu分別培養(yǎng)1、2、4、6、8、10h，結(jié)果表明，Glu誘導(dǎo)PC12損傷具有一定的劑量依賴性和時(shí)間依賴性

5、。最終，確定谷氨酸模型的條件為15mmol/L孵育細(xì)胞6h，此時(shí)，細(xì)胞存活率約為50％，并且細(xì)胞形態(tài)和MTT甲瓚顆粒的分布發(fā)生了明顯改變。
　　2.用不同濃度（200、400、600、800、1000μg/mL）的GLGZD分別作用PC12細(xì)胞24h、48h，發(fā)現(xiàn)GLGZD在24h無細(xì)胞毒性作用;用GLGZD預(yù)先保護(hù)后，發(fā)現(xiàn)PC12細(xì)胞形態(tài)得到改善，損傷細(xì)胞減少，細(xì)胞增殖活性顯著提高(p＜0.05)，LDH釋放減少，SOD酶活性升

6、高(p＜0.05)，MDA含量降低(p＜0.05)，并且能降低Glu介導(dǎo)PC12細(xì)胞的凋亡率。
　　3.GLGZD處理細(xì)胞后，較模型組相比，可顯著降低Caspase-3的相對活性(p＜0.05)，上調(diào)Bcl-2/Bax比值(p＜0.05)，降低Bax mRNA相對表達(dá)量，升高Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量。
　　結(jié)論:
　　1.GLGZD對Glu誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用。
　　2.GLGZD對Glu誘