富勒烯-蛋氨酸衍生物的合成及其對PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用.pdf

1、生命過程中的自由基反應(yīng)處于動態(tài)平衡之中，過多的自由基引起的氧化損傷將會導(dǎo)致細(xì)胞損傷、病變和非正常死亡，是多種疾病的發(fā)病根源。研究證實(shí)：有超過100種疾病與自由基產(chǎn)生過量或人體自身清除自由基能力下降有關(guān)，因此自由基被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)稱為致病中介因子。相對于其它組織而言，神經(jīng)組織由于含有豐富的多不飽和脂肪酸以及缺乏足夠的抗氧化酶而對氧化應(yīng)激損傷特別敏感，加之其不可再生性，使得研究有效的自由基清除劑具有重要的意義。 富勒烯(fullerene

2、)的出現(xiàn)為研究自由基清除劑開辟了新的思路。富勒烯是碳的第三種同素異形體，其中的突出代表為C60。富勒烯衍生物特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)使得一分子富勒烯能與多分子的活性氧反應(yīng)，因此富勒烯被譽(yù)為“吸收自由基的海綿”。許多研究表明，C60衍生物在吸收自由基，保護(hù)缺血再灌注對機(jī)體組織的損傷，保護(hù)紫外線對人角化細(xì)胞損傷具有良好的應(yīng)用前景。事實(shí)上，由于富勒烯水溶性很低，阻礙了其在生物學(xué)上的應(yīng)用，因此，富勒烯水溶性問題是當(dāng)今富勒烯研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前，解決富勒烯

3、水溶性的方案以往主要有以下三種措施：①制備富勒烯水溶性包合物；②制備富勒烯水溶膠；③在富勒烯碳籠上添加水溶性基團(tuán)，合成制備富勒烯的水溶性衍生物。三種方法中以制備水溶性富勒烯衍生物(SFD)最具有前景。 鑒于此，本研究利用有機(jī)合成的方法制備出一種C60-氨基酸衍生物(FAAD)——C60-蛋氨酸(FMD)，并對它們進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征；同時(shí)還研究其對羥自由基和超氧陰離子的清除能力及規(guī)律，以及其對經(jīng)過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)后引起PC12大

4、鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，為該類化合物在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分、富勒烯-蛋氨酸衍生物的合成與表征 目的：合成水溶性的富勒烯氨基酸衍生物。 方法：利用親核加成機(jī)理將蛋氨酸引入C60球上，并用FT-IR、1H-NMR、RF、UV及粒度分析元素分析等手段對這些物質(zhì)進(jìn)行表征。 結(jié)果：產(chǎn)物在常溫下易溶于水，并能穩(wěn)定存在；FT-IR、1H-NMR、RF、UV都直接或間接地證實(shí)蛋氨

5、酸以共價(jià)鍵的方式接到了C60上，粒度分析顯示1 mg/ml的C60-蛋氨酸衍生物在水溶液中的平均粒徑分別為11.1 nm。 結(jié)論：成功地合成了C60-蛋氨酸衍生物，該物質(zhì)具有良好的水溶性。 第二部分、富勒烯-蛋氨酸衍生物對PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用 目的：研究FMD對活性氧的清除能力和對H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制。 方法：將不同濃度的FMD加入鄰苯三酚-魯米諾(PA-L)自

6、氧化發(fā)光體系和鄰菲羅啉發(fā)光體系，觀察FMD對發(fā)光強(qiáng)度的抑制作用，以此分別評價(jià)對超氧陰離子(O2·-)和羥自由基(·OH)的清除能力；體外培養(yǎng)PC12細(xì)胞株，在培養(yǎng)液中預(yù)先加入不同濃度的FMD后，以500μMH2O2誘導(dǎo)PC12損傷，通過MTT比色法觀察不同濃度FMD保護(hù)作用下PC12的存活情況，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，采用單細(xì)胞凝膠電泳法測定DNA單鏈損傷，化學(xué)比色法檢測胞內(nèi)外MDA含量和SOD活性，熒光法檢測進(jìn)入胞內(nèi)FMD的量。

7、 結(jié)果：隨著FMD濃度的增加，活性氧抑制率逐漸升高；經(jīng)H2O2誘導(dǎo)后細(xì)胞出現(xiàn)明顯損傷形態(tài)，細(xì)胞存活率明顯下降，胞內(nèi)DNA鏈損傷明顯增加，胞內(nèi)外MDA含量明顯增加，SOD活力明顯下降；而預(yù)先加入FMD可改善上述結(jié)果，細(xì)胞凋亡率明顯降低，細(xì)胞內(nèi)DNA鏈損傷明顯減少，顯著降低MDA含量，提高SOD活性，其作用呈劑量依賴關(guān)系；另外，大概有20％的FMD進(jìn)入細(xì)胞。 結(jié)論：FMD由很好的清除自由基的能力；對H2O2誘導(dǎo)PCl2細(xì)胞損