腦缺血預處理增強大鼠海馬CA1區(qū)膠質(zhì)細胞谷氨酸轉運體-1的結合特性及其對谷氨酸的攝取.pdf

1、目的：谷氨酸是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一種主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，通過作用于一系列的興奮性氨基酸受體在神經(jīng)元通信以及神經(jīng)病理性損傷方面發(fā)揮重要作用。興奮性氨基酸轉運體是調(diào)控腦內(nèi)細胞外液谷氨酸濃度的重要機制，其中星形膠質(zhì)細胞谷氨酸轉運體-1（Glial glutamate transporter-1，GLT-1）在終止谷氨酸能神經(jīng)傳遞，維持細胞外液谷氨酸濃度處于正常水平方面發(fā)揮重要作用。
　　 本室研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠腦缺血耐受模型中，腦

2、缺血預處理（cerebral ischemic preconditioning，CIP）可抑制全腦缺血打擊引起的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡（delayed neuronal death，DND），同時上調(diào)海馬CA1區(qū)GLT-1的表達、降低腦缺血打擊后海馬CA1區(qū)細胞外液中的谷氨酸濃度，并且DHK（GLT-1的特異性抑制劑）和GLT-1的反義寡核苷酸則能劑量依賴性的阻斷CIP對神經(jīng)元的這種保護作用。這些結果提示，GLT-1在CIP

3、腦保護機制中發(fā)揮重要作用。
　　 但是，在CIP誘導腦缺血耐受過程中，GLT-1轉運體的功能，包括與谷氨酸的結合特性以及對谷氨酸的攝取是否發(fā)生變化，尚未見研究報道。因此，本實驗采用腦組織病理學方法、放射性配基結合方法、L-3H-glutamate標記法，在確定CIP誘導腦缺血耐受的基礎上，觀察這一過程中GLT-1轉運體的數(shù)量和親和力以及對谷氨酸的攝取的變化，為闡明GLT-1在腦缺血耐受誘導中的作用提供進一步的實驗依據(jù)，為臨床上腦

4、血管疾病的防治研究提供新的線索和思路。
　　 方法：200只永久凝閉雙側椎動脈的（Control組大鼠除外）Wistar大鼠（280～300 g）隨機分為以下5組：
　　 （1）Control組（n=12）：不做任何處理；
　　 （2）Sham組（n=47）：行全腦缺血的sham手術，即只分離暴露、但不夾閉雙側頸總動脈。
　　 （3）CIP組（n=47）：全腦缺血3 min作為CIP，之后恢復腦血液再灌流

5、。
　　 （4）腦缺血打擊組（n=47）：全腦缺血8 min作為腦缺血打擊，之后恢復腦血液再灌流。
　　 （5）CIP+腦缺血打擊組（n=47）：首先行CIP3 min，恢復腦血液再灌流2天后，行全腦缺血8 min后恢復腦血液灌注。
　　 除control組外，以上各組于sham手術或末次腦缺血再灌注后0 h、1 h、1 d、2 d、3 d、5 d、和7 d取材觀察。其中7 d組動物（n=5）用于觀察海馬CA1區(qū)

6、組織病理學變化；其余各組（n=7）用于GLT-1功能的測定，其中4只動物用于GLT-1的數(shù)量和親和力的測定，3只動物用于GLT-1對谷氨酸攝取率的測定。
　　 采用四血管閉塞法制造大鼠全腦缺血模型。首先凝閉雙側椎動脈，2天后夾閉雙側頸總動脈致大鼠全腦缺血；夾閉雙側頸總動脈3 min作為CIP，夾閉8 min作為腦缺血打擊；二者都給予時間隔2d。全腦缺血的sham手術包括除不夾閉雙側頸總動脈以外的所有步驟。
　　 海馬CA

7、1區(qū)組織病理學變化采用常規(guī)組織學切片、硫堇染色，光鏡下確定組織學分級和神經(jīng)元密度，評價DND發(fā)生情況。組織學分級（histological grade，HG）標準如下：0級，無神經(jīng)元死亡；Ⅰ級，散在神經(jīng)元死亡；Ⅱ級，成片神經(jīng)元死亡；Ⅲ級，幾乎全部的神經(jīng)元死亡。計數(shù)海馬CA1區(qū)每1 mm區(qū)段內(nèi)細胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細胞數(shù)目，每張切片雙側海馬各計數(shù)3個區(qū)段取平均數(shù)為神經(jīng)元密度（Neuronal density，ND）。

8、　　 GLT-1的數(shù)量和親和力的測定采用放射性配基結合法，分別以Bmax和Kd值表示，以總結合減去非特異性結合計算GLT-1的Bmax和Kd值。Bmax值越大，表明GLT-1的數(shù)量越多；Kd值越小，表明GLT-1對谷氨酸的親和力越大。對谷氨酸攝取率的測定采用3H-標記谷氨酸法，以總攝取減去非特異性攝取作為GLT-1對谷氨酸的攝取。
　　 結果：
　　 1 CIP減輕全腦缺血引起的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元DND
　　

9、 Control組與Sham大鼠海馬CA1區(qū)無錐體神經(jīng)元死亡，HG均為0級，ND值分別為208±1.31和198.67±9.35。CIP組大鼠海馬CA1區(qū)組織學特征與control和sham組大鼠類似，HG為0～Ⅰ級，ND值為192±18.93。腦缺血打擊組大鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)明顯的DND，與以上三組相比，HG（Ⅱ～Ⅲ級）明顯升高（P<0.01），ND值（29.33±13.06）顯著降低（P<0.01）。CIP+腦缺血打擊組海馬CA1

10、區(qū)DND不明顯，與腦缺血打擊組相比，HG（0～Ⅰ級）明顯降低（P<0.01），ND值（166.67±10.98）顯著升高（P<0.01），表明CIP可以誘導海馬CA1區(qū)神經(jīng)元產(chǎn)生缺血性耐受，對抗缺血打擊引起的DND。
　　 2 CIP增加大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1的數(shù)量和親和力
　　 2.1 Bmax值的變化
　　 與正常control組相比，Sham組Bmax值有一定程度的升高，特別是在sham手術后1d至3d

11、（P<0.05），表明sham手術對GLT-1的數(shù)量有一定影響。CIP組Bmax值明顯升高，2d時達到高峰（P<0.05 vs0h、1h和24h），并可持續(xù)至CIP后5d，與sham組同時間點相比均顯著增加（P<0.05）。腦缺血打擊后Bmax呈現(xiàn)下降趨勢，3d時降至最低（P<0.05 vs0h和1h組）；與sham組相比，腦缺血打擊后0h和1h的Bmax值雖有一定程度的升高，但無統(tǒng)計學意義，而腦缺血打擊后2d、3d和5d組的Bmax值

12、則較sham組同時間點顯著降低（P<0.05）。CIP+腦缺血打擊組Bmax值變化趨勢同CIP組，但末次腦缺血后24h即開始升高（P<0.05 vs0h和1h組），2d時達到高峰，并持續(xù)到全腦缺血后5d；除0h組外，其余各時間點均較腦缺血打擊組顯著增加（P<0.05）；此外，與CIP組相比，除0h、1h和5d組外，其余各時間點均顯著增加（P<0.05）。
　　 2.2 Kd值的變化
　　 與control組相比，sham

13、組在各個時間點的kd值均無顯著性變化。與sham組相比，CIP后2d的Kd值顯著降低（P<0.05），而腦缺血打擊組的Kd值則有升高趨勢，尤以腦缺血打擊后2d（P<0.05）最為顯著，至5d時基本恢復至sham組水平。而在腦缺血打擊前預先給予CIP（CIP+腦缺血打擊組），則可明顯抑制腦缺血打擊引起的Kd值的升高，表現(xiàn)為除3d和5d外，其余各時間點的Kd值均較腦缺血打擊組顯著降低（P<0.05）。
　　 3 CIP提高大鼠海馬C

14、A1區(qū)GLT-1對谷氨酸的攝取率
　　 與control組相比，Sham組的谷氨酸攝取率在各個時間點無明顯差別。CIP后，谷氨酸的攝取明顯增加（P<0.05），尤以CIP后的早期；隨時間的推移，谷氨酸的攝取逐漸下降，但5d時仍高于sham組。腦缺血打擊組谷氨酸的攝取率呈現(xiàn)下降趨勢，以3d時較為明顯。CIP+腦缺血打擊組谷氨酸的攝取變化趨勢與CIP組類似，但谷氨酸攝取的增加更加明顯，并且在5d時仍保持在較高水平。
　　 結