腦缺血耐受對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT-1mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、目的：谷氨酸是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一種主要的興奮型神經(jīng)遞質(zhì)，但同時(shí)它又是一種潛在的神經(jīng)毒素，大量研究表明，腦缺血時(shí)細(xì)胞外液中谷氨酸等興奮性氨基酸（EAA）的濃度異常升高，這些興奮性氨基酸作用于相應(yīng)受體，導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷或死亡。因此，又被稱為興奮性神經(jīng)毒素。降低腦缺血時(shí)細(xì)胞外液中谷氨酸濃度，可以防治其興奮性神經(jīng)毒作用，以達(dá)到減輕缺血時(shí)神經(jīng)元損傷的目的。
　　 膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1（GLT-1）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量最豐富、功能最

2、強(qiáng)大的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，在終止谷氨酸能神經(jīng)傳遞，維持細(xì)胞外液谷氨酸濃度處于低水平，從而防止其興奮性神經(jīng)毒作用方面發(fā)揮重要作用。
　　 本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)腦缺血預(yù)處理(CIP)可使星形膠質(zhì)細(xì)胞突起延長并且表達(dá)大量的GLT-1，其對(duì)谷氨酸的攝取增強(qiáng)，該變化保護(hù)錐體神經(jīng)元使其能夠耐受較嚴(yán)重的、通常會(huì)引起遲發(fā)性神經(jīng)元死亡(DND)的缺血打擊。本次實(shí)驗(yàn)的目的是觀察腦缺血耐受誘導(dǎo)過程中，大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和齒狀回GLT-1 mRNA

3、的表達(dá)變化，進(jìn)一步闡明GLT-1在腦缺血時(shí)的作用和機(jī)制，為臨床上腦缺血的防治提供新思路。
　　 方法：采用四血管閉塞法(4VO)大鼠全腦缺血模型。選取健康雄性Wister大鼠(280-310g)135只，隨機(jī)分為5組。除control組之外，其余大鼠均首先永久凝閉椎動(dòng)脈，恢復(fù)2天后，進(jìn)行sham手術(shù)或腦缺血處理，具體分組如下：
　　 ①control組(n=3)：不給予任何處理；
　　 ②sham組(n=33)：

4、只暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不阻斷血流；
　　 ③腦缺血預(yù)處理(CIP)組(n=33)：夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3min后恢復(fù)再灌注；
　　 ④損傷性缺血(ischemic insult，Ⅱ)組(n=33)：夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8min后恢復(fù)再灌注；
　　 ⑤腦缺血預(yù)處理+損傷性缺血(CIP+Ⅱ)組(n=33)：夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3min后恢復(fù)血液再灌注，作為腦缺血預(yù)處理，2天后，再次夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈8min作為損傷性缺血，然后恢復(fù)再

5、灌注。
　　 除control組之外，其余四組又各分為11個(gè)時(shí)間點(diǎn)，均于再灌注后即刻(0min)、30min、1h、3h、6h、12h、1d、2d、3d、5d、7d時(shí)斷頭取海馬腦組織，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=3。
　　 結(jié)果：
　　 1、神經(jīng)病理學(xué)評(píng)價(jià)
　　 硫堇染色顯示，control組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元排列整齊致密，可見2～3層，細(xì)胞形態(tài)完整、邊界清晰、尼氏小體豐富，胞核大而圓、核仁清晰，ND為202±

6、8.57(cell/mm)。sham組大鼠各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)均未見明顯損傷，與control組相比，ND均無明顯變化。CIP組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)均未見明顯損傷，與sham組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，ND均無明顯變化。損傷性腦缺血(Ⅱ)組在全腦缺血8min后5d和7d時(shí)，神經(jīng)元幾乎全部死亡，ND為31±11.61(cell/mm)。與sham組相比，明顯減少。CIP+Ⅱ組在各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞均未見明顯損傷、亦無明顯細(xì)胞缺失，與損

7、傷性腦缺血后7d組相比，ND為147±10.31(cell/mm)，明顯升高。表明CIP誘導(dǎo)了海馬CA1區(qū)神經(jīng)元產(chǎn)生缺血耐受，使其能夠抵抗通常會(huì)引起明顯DND的嚴(yán)重腦缺血。
　　 sham組、CIP組各時(shí)間點(diǎn)，大鼠海馬CA3區(qū)和DG區(qū)均未見到神經(jīng)元損傷，鏡下可見細(xì)胞形態(tài)完整、邊界清晰，CA3區(qū)錐體神經(jīng)元胞體較大，排列較為松散，共2～3層；但DG區(qū)顆粒細(xì)胞胞體較小，排列緊密，共5～6層。Ⅱ組大鼠海馬CA3區(qū)和DG亦未見明顯的神經(jīng)元

8、損傷，僅個(gè)別神經(jīng)元出現(xiàn)DND，表現(xiàn)為鏡下可見少量濃縮深染的CA3區(qū)椎體神經(jīng)元及DG區(qū)顆粒細(xì)胞，與各自對(duì)應(yīng)的sham組比較，7d時(shí)間點(diǎn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；CIP+Ⅱ組大鼠海馬CA3區(qū)和DG區(qū)未見明顯損傷。
　　 以上結(jié)果表明，CIP誘導(dǎo)海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元產(chǎn)生了缺血耐受，保護(hù)神經(jīng)元使其能夠耐受通常情況下其無法耐受嚴(yán)重腦缺血；CA3區(qū)和DG區(qū)對(duì)于可以引起明顯CA1區(qū)神經(jīng)元DND的嚴(yán)重腦缺血（全腦缺血8min)有較強(qiáng)的耐受能力。

9、　　 2、原位雜交法觀察GLT-1 mRNA在海馬CA1區(qū)的表達(dá)
　　 GLT-1 mRNA原位雜交染色顯示，control組海馬CA1區(qū)可見錐體神經(jīng)元排列整齊，共2～3層。神經(jīng)元呈圓形，形態(tài)完整，邊界可見，胞漿輕微著色，呈淺棕黃色，胞核基本不著色。
　　 sham組神經(jīng)元形態(tài)完整，邊界清楚，胞漿著色明顯，呈棕色，少量細(xì)胞的胞核在0min～6h著色較淺、其余時(shí)間點(diǎn)不著色。與control組相比，在0min、30min、

10、1h、3h、6h、12h、1d時(shí)間點(diǎn)GLT-1 mRNA表達(dá)的積分光密度明顯升高，其中以0min～6h較為明顯；其余時(shí)間點(diǎn)GLT-1mRNA表達(dá)的積分光密度均無明顯差異。
　　 CIP組神經(jīng)元形態(tài)依然完整，邊界清楚。神經(jīng)元著色在6h、12h、1d、2d時(shí)比較明顯，以12h最為突出，神經(jīng)元幾乎呈均勻一致的棕色，胞核與胞漿的界限不清；6h、1d時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)為胞漿明顯著色，僅個(gè)別神經(jīng)元胞核著色；2d時(shí)間點(diǎn)，胞漿著色雖明顯降低，但與即刻時(shí)

11、間點(diǎn)相比，仍較深；此后神經(jīng)元著色明顯變淺。與sham組相比，GLT-1 mRNA表達(dá)的積分光密度在6h、12h、1d、2d時(shí)明顯升高。
　　 Ⅱ組早期CA1區(qū)錐體神經(jīng)元形態(tài)無明顯改變，但神經(jīng)元染色逐漸變淺；5d、7d時(shí)，正常形態(tài)的錐體神經(jīng)元幾乎完全消失。與sham組相比，GLT-1 mRNA的積分光密度在6h、12h、1d、3d時(shí)明顯降低。
　　 CIP+Ⅱ組，神經(jīng)元形態(tài)依然完整，邊界清楚。在早期神經(jīng)元染色加深，在6h、

12、12h、1d、2d時(shí)神經(jīng)元染色明顯加深，以6h、12h、1d時(shí)最深，胞核及胞漿界限無法辨識(shí)，均染為棕色，在12h時(shí)間點(diǎn)最為突出；2d時(shí)神經(jīng)元染色逐漸變淺，以胞漿著色為主，有少量胞核著色；此后，神經(jīng)元著色更淺。與Ⅱ組相比，GLT-1 mRNA表達(dá)的積分光密度在個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯升高。
　　 3、原位雜交法觀察大鼠海馬CA3區(qū)GLT-1 mRNA的表達(dá)
　　 原位雜交染色顯示，control組海馬CA3區(qū)，可見錐體神經(jīng)元2～3層

13、，排列比較松散。神經(jīng)元呈圓形，形態(tài)完整，邊界可見，胞漿著色，呈棕色，胞核基本不著色。
　　 sham組神經(jīng)元形態(tài)完整，邊界清楚，胞漿著色，呈棕色，與control組相比，在0min、30min、1h、3h、6h、12h、1d時(shí)間點(diǎn)著色加深，以胞漿為主，胞核基本不著色，GLT-1 mRNA表達(dá)的積分光密度有明顯升高;2d后GLT-1 mRNA的表達(dá)明顯下降，與control組相比，2d、3d、5d、7d時(shí)間點(diǎn)GLT-1 mRNA表

14、達(dá)的積分光密度無明顯差異。
　　 CIP組神經(jīng)元形態(tài)依然完整，邊界清楚，胞漿著色明顯。神經(jīng)元著色在6h、12h、1d時(shí)比較突出，其中12h時(shí)最明顯，有一定量的胞核著色，與sham組的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，GLT-1 mRNA表達(dá)的積分光密度有明顯升高。2d時(shí)間點(diǎn)，胞漿著色仍較深，基本不存在胞核著色；此后神經(jīng)元著色逐漸變淺，與sham組的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，GLT-1 mRNA表達(dá)的積分光密度均無明顯差異。
　　 Ⅱ組神經(jīng)元形態(tài)依然

15、完整，邊界清楚，胞漿著色明顯。神經(jīng)元著色在12h、1d時(shí)比較突出，其中12h時(shí)最明顯，神經(jīng)元幾乎呈均勻一致的棕色，胞核與胞漿的界限不清，與sham組的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，GLT-1 mRNA表達(dá)的積分光密度有明顯升高。2d、3d、5d時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元著色逐漸變淺，與sham組的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，GLT-1 mRNA表達(dá)的積分光密度無明顯差異。
　　 CIP+Ⅱ組神經(jīng)元形態(tài)依然完整，邊界清楚，胞漿著色明顯。神經(jīng)元著色在6h、12h、1d時(shí)比

16、較突出，其中12h時(shí)最明顯，神經(jīng)元幾乎呈均勻一致的棕色，胞核與胞漿的界限不清，與sham組的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，GLT-1mRNA表達(dá)的積分光密度明顯升高。2d、3d、5d、7d時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元著色逐漸變淺，與sham組的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，GLT-1 mRNA表達(dá)的積分光密度無明顯變化。
　　 4、原位雜交法觀察大鼠海馬DG GLT-1 mRNA的表達(dá)
　　 GLT-1 mRNA原位雜交染色顯示，control組海馬DG顆粒細(xì)胞形

17、態(tài)完整，可見神經(jīng)元細(xì)胞5～6層，排列整齊、緊密。神經(jīng)元呈圓形，形態(tài)完整，邊界可見，胞漿著色較淺，呈棕色，胞核基本不著色。
　　 sham組神經(jīng)元形態(tài)完整，邊界清楚，胞漿著色明顯，呈棕色，胞核在0min～12h著色，其中在0min～3h時(shí)比較突出；與control組相比，GLT-1mRNA表達(dá)的積分光密度在0min～12h明顯升高；其余時(shí)間點(diǎn)基本不著色或著色較淺，與control組相比，GLT-1 mRNA表達(dá)的積分光密度無明顯升

18、高。
　　 CIP組神經(jīng)元整體形態(tài)完整，邊界清楚，胞漿著色明顯，呈棕色，胞核在0min～2d著色明顯，其余時(shí)間點(diǎn)基本不著色。與sham組的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，GLT-1 mRNA表達(dá)的積分光密度無明顯升高。
　　 Ⅱ組神經(jīng)元形態(tài)依然完整，邊界清楚，胞漿著色明顯。神經(jīng)元著色在3h、6h、12h、1d、2d、3d時(shí)較深，其中12h、1d、2d、3d時(shí)最明顯，神經(jīng)元幾乎呈均勻一致的棕色，胞核與胞漿的界限不清，與sham組的相應(yīng)時(shí)間

19、點(diǎn)相比，GLT-1 mRNA表達(dá)的積分光密度在12h～3d明顯升高。其余時(shí)間點(diǎn)著色較淺或基本不著色，與sham組的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，GLT-1 mRNA表達(dá)的積分光密度無顯著變化。
　　 CIP+Ⅱ組神經(jīng)元形態(tài)依然完整，邊界清楚，胞漿、胞核均明顯著色。神經(jīng)元著色在1h、3h、6h、12h、1d時(shí)比較突出，神經(jīng)元幾乎呈均勻一致的棕色，胞核與胞漿的界限不清，其余時(shí)間點(diǎn)胞核著色較淺，但依然著色。與sham組的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，GLT-1

20、mRNA表達(dá)的積分光密度在1h～7d均明顯升高。
　　 結(jié)論：
　　 1、8min全腦缺血可以導(dǎo)致大鼠海馬CA1區(qū)大量錐體神經(jīng)元發(fā)生明顯DND，而提前2天的3min缺血預(yù)處理可以保護(hù)錐體神經(jīng)元，使其能夠耐受通常會(huì)引起明顯DND的8min損傷性缺血。
　　 2、原位雜交顯示，3min的缺血預(yù)處理可以引起大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1mRNA的表達(dá)上調(diào)。該變化可能保護(hù)CA1區(qū)錐體神經(jīng)元使其能夠耐受隨后的損傷性缺血打擊，參

21、與缺血預(yù)處理的腦保護(hù)作用。
　　 3、8min全腦缺血可以導(dǎo)致大鼠海馬CA1區(qū)大量錐體神經(jīng)元發(fā)生明顯DND，同時(shí)觀察到CA1區(qū)GLT-1 mRNA的表達(dá)明顯減少；但8min全腦缺血未導(dǎo)致大鼠海馬CA3區(qū)和DG神經(jīng)元明顯受損，同時(shí)他們的GLT-1mRNA的表達(dá)上調(diào)。
　　 4、CIP+Ⅱ組與Ⅱ組相比，原位雜交顯示大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元GLT-1mRNA表達(dá)明顯增多，該變化可能保護(hù)CA1區(qū)錐體神經(jīng)元使其能夠耐受隨后的損傷