頭孢曲松鈉通過調(diào)制膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1發(fā)揮抗全腦缺血性腦損傷作用.pdf

1、目的：谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，也是細(xì)胞通訊傳遞、生長、分化和可塑性的重要調(diào)質(zhì)。然而，谷氨酸的過度蓄積會引起神經(jīng)元的死亡。興奮性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體是調(diào)節(jié)谷氨酸濃度的主要途徑，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1（glutamate transporter-1，GLT-1）在終止谷氨酸能神經(jīng)傳遞，維持細(xì)胞外液谷氨酸濃度處于正常水平方面發(fā)揮重要作用。
　　 2005年Rothstein等報(bào)道，β-內(nèi)酰胺類抗生素頭孢曲松鈉（Ceftr

2、iaxone，Cef）可以特異性地增強(qiáng)GLT-1的表達(dá)和對谷氨酸的攝取。隨后，韓國學(xué)者Chu于2007年報(bào)道Cef能通過上調(diào)GLT-1的表達(dá)縮小大腦中動脈閉塞性腦梗塞的梗死灶范圍。最近研究發(fā)現(xiàn)：在大腦中動脈閉塞性腦缺血動物模型中，Cef可以明顯降低動物的死亡率、改善神經(jīng)功能、提高存活率。我室研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠全腦缺血耐受模型中，預(yù)防性給予GLT-1的特異性激動劑Cef可上調(diào)大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1蛋白的表達(dá)，并且減輕全腦缺血引起的海馬C

3、A1區(qū)錐體神經(jīng)元遲發(fā)性死亡（delayed neuronal death，DND）。但是在全腦缺血模型中，Cef是否是通過上調(diào)GLT-1蛋白的表達(dá)和功能來發(fā)揮抗腦缺血作用尚有待于進(jìn)一步證實(shí)。
　　 因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠四血管閉塞全腦缺血整體動物模型，觀察GLT-1的反義寡核苷酸（antisense oligodeoxy-nucleotides，AS-ODNs）對Cef誘導(dǎo)的GLT-1表達(dá)上調(diào)和功能改變、以及腦缺血耐受的影響，進(jìn)一

4、步證實(shí)Cef通過上調(diào)GLT-1蛋白表達(dá)和功能發(fā)揮抗全腦缺血性腦損傷作用，為臨床上腦血管疾病的防治研究提供新的線索和依據(jù)。
　　 1 GLT-1 AS-ODNs抑制Cef誘導(dǎo)的GLT-1表達(dá)上調(diào)和腦缺血耐受
　　 1.1 GLT-1 AS-ODNs對Cef引起的大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1蛋白表達(dá)上調(diào)的影響
　　 動物分組及方法：將120只凝閉雙側(cè)椎動脈的雄性Wistar大鼠（270-320 g）隨機(jī)分為以下兩部分共

5、6組：
　　 1.1.1 GLT-1 AS-ODNs對Cef引起的sham大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1蛋白表達(dá)上調(diào)的影響
　　 （1）sham組（n=10）：行全腦缺血的sham手術(shù)，即只暴露但不夾閉雙側(cè)頸總動脈，于sham手術(shù)后12 h（n=5）和24 h（n=5）取海馬CA1區(qū)觀察GLT-1表達(dá)的變化。
　　 （2）Cef+sham組（n=10）：腹腔注射Cef（200 mg/kg），每日一次，共5次；末次Ce

6、f注射后1 d行全腦缺血的sham手術(shù)；其它同sham組。
　　 （3）AS-ODNs+Cef+sham組（n=40）：在Cef+sham組的基礎(chǔ)上，于第一次注射Cef后36 h、72 h以及sham手術(shù)前12 h右側(cè)腦室注射GLT-1 AS-ODNs雙蒸水溶液10μl，設(shè)9nmol和18 nmol兩個劑量組；其它同sham組。同時(shí)設(shè)雙蒸水（AS-ODNs溶劑）對照組（n=10）和無意義寡核苷酸（random oligodeox

7、ynucleotides，R-ODNs，18 nmol）對照組（n=10）。
　　 1.1.2 GLT-1 AS-ODNs對Cef引起的全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1蛋白表達(dá)上調(diào)的影響
　　 在上述sham組的基礎(chǔ)上，增加以下3組：
　　 （4）全腦缺血組（n=10）：全腦缺血8 min后恢復(fù)血液再灌流；于全腦缺血后12 h（n=5）和24 h（n=5）取海馬CA1區(qū)觀察GLT-1表達(dá)變化。
　　 （

8、5）Cef+全腦缺血組（n=10）：腹腔注射Cef，每天一次，共5次；末次Cef注射后1 d行全腦缺血8 min；其它同全腦缺血組。
　　 （6）AS-ODNs+Cef+全腦缺血組（n=40）：在Cef+全腦缺血組的基礎(chǔ)上，于第一次注射Cef后36 h、72 h以及全腦缺血手術(shù)前12 h右側(cè)腦室注射GLT-1 AS-ODNs雙蒸水溶液10μl，設(shè)9 nmol（n=5）和18 nmol（n=5）兩個劑量組；其它同全腦缺血組。同時(shí)設(shè)

9、雙蒸水（AS-ODNs溶劑）對照組（n=10）和R-ODNs（18 nmol）對照組（n=10）。
　　 以上各組均以Western免疫印跡分析法檢測大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1的表達(dá)，以GLT-1與β-actin免疫條帶的積分光密度（integral optical density，IOD）比值表達(dá)GLT-1的相對表達(dá)量，比值越大，表達(dá)越多。
　　 結(jié)果：Sham組大鼠可見海馬CA1區(qū)GLT-1蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)。與sham

10、組相比，Cef+sham組GLT-1表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05）。與Cef+sham組相比，AS-ODNs（18 nmol）+Cef+sham組GLT-1的表達(dá)明顯降低（P<0.05），而雙蒸水對照組、AS-ODNs9 nmol組和R-ODNs18 nmol對照組GLT-1的表達(dá)均無明顯變化（P>0.05）。
　　 與sham組相比，全腦缺血打擊后GLT-1的表達(dá)無明顯變化。與全腦缺血組相比，Cef+全腦缺血組GLT-1的表達(dá)明

11、顯上調(diào)（P<0.05）。與Cef+全腦缺血組相比，AS-ODNs（18nmol）+Cef+全腦缺血組GLT-1的表達(dá)明顯降低（P<0.05），而雙蒸水對照組、AS-ODNs9 nmol組和R-ODNs（18 nmol）對照組GLT-1的表達(dá)無顯著變化。
　　 上述結(jié)果表明，Cef可上調(diào)sham和全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1的表達(dá)，而預(yù)先給予GLT-1 As-ODNs可有效抑制Cef引起的GLT-1表達(dá)的上調(diào)。
　　

12、 1.2 GLT-1 AS-ODNs抑制Cef抗全腦缺血引起的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元DND的作用
　　 動物分組及方法：將40只凝閉雙側(cè)椎動脈的雄性Wistar大鼠（270-320 g）隨機(jī)分為6組：
　　 （1）sham組（n=5）：行全腦缺血的sham手術(shù)，于sham手術(shù)后7 d取材觀察海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元DND情況。
　　 （2）Cef對照組（n=5）：腹腔注射Cef（200 mg/kg），每日一次，共5

13、次；末次Cef注射后1 d行全腦缺血的sham手術(shù)；其它同sham組。
　　 （3）AS-ODNs對照組（n=5）：于sham手術(shù)前3.5 d，2 d以及12 h右側(cè)腦室注射GLT-1 AS-ODNs（18 nmol）雙蒸水溶液10μl，共注射3次；上述時(shí)間點(diǎn)與AS-ODNs+Cef+全腦缺血組注射AS-ODNs的時(shí)間點(diǎn)相對應(yīng)。其它同sham組。
　　 （4）全腦缺血組（n=5）：全腦缺血8 min后恢復(fù)血液再灌流，于全

14、腦缺血后7 d取材觀察海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元DND情況。
　　 （5）Cef+全腦缺血組（n=5）：腹腔注射Cef，每天一次，共5次；末次Cef注射后1 d行全腦缺血8 min；其它同全腦缺血組。
　　 （6）AS-ODNs+Cef+全腦缺血組（n=15）：在Cef+全腦缺血組的基礎(chǔ)上，于第一次注射Cef后36 h、72 h以及全腦缺血手術(shù)前12 h右側(cè)腦室注射GLT-1 AS-ODNs雙蒸水溶液10μl，分為9 nmo

15、l和18 nmol兩個劑量；其它同全腦缺血組。同時(shí)設(shè)R-ODNs（18 nmol）對照組（n=5）。
　　 以上各組均以硫堇染色法觀察大鼠海馬CA1區(qū)DND情況，確定組織學(xué)分級（histological grade，HG）和神經(jīng)元密度（neuronal density，ND）。
　　 2 Cef增加大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1對谷氨酸的攝取
　　 動物分組與方法：將80只凝閉雙側(cè)椎動脈的雄性Wistar大鼠（270

16、-320 g）隨機(jī)分為5組：
　　 （1）sham組（n=10）：行全腦缺血的sham手術(shù)，于sham手術(shù)后12 h（n=5）和24 h（n=5）取海馬CA1區(qū)觀察GLT-1對谷氨酸攝取的變化。
　　 （2）Cef對照組（n=10）：腹腔注射Cef（200 mg/kg），每日一次，共5次；末次Cef注射后1 d行全腦缺血的sham手術(shù)；其它同sham組。
　　 （3）全腦缺血組（n=10）：全腦缺血8 min后恢

17、復(fù)血液再灌流，于全腦缺血后12 h（n=5）和24 h（n=5）取海馬CA1區(qū)觀察GLT-1對谷氨酸攝取的變化。
　　 （4）Cef+全腦缺血組（n=10）：腹腔注射Cef，每天一次，共5次；末次Cef注射后1 d行全腦缺血；其它同全腦缺血組。
　　 （5）AS-ODNs+Cef+全腦缺血組（n=40）：在Cef+全腦缺血組的基礎(chǔ)上，于第一次注射Cef后36 h、72 h以及全腦缺血手術(shù)前12 h右側(cè)腦室注射GLT-1

18、AS-ODNs雙蒸水溶液10μl，分別注射9 nmol和18 nmol兩個劑量；其它同全腦缺血組。同時(shí)設(shè)雙蒸水（AS-ODNs溶劑）對照組（n=10）和R-ODNs（18 nmol）對照組（n=10）。
　　 以上各組均用[3H]-谷氨酸測定海馬CA1區(qū)GLT-1對谷氨酸的攝取。
　　 結(jié)論：
　　 預(yù)防性給予GLT-1的特異性激動劑Cef可上調(diào)大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1的表達(dá)及其對谷氨酸的攝取，同時(shí)增強(qiáng)海馬CA