氟對(duì)培養(yǎng)大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性研究.pdf

1、目的:通過(guò)探討不同劑量NaF誘導(dǎo)體外培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和5’-NT、SDH、ACP活性變化機(jī)制，為進(jìn)一步研究氟的中樞毒性機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:(1)通過(guò)體外分離純化培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的方法，獲得純度達(dá)98％以上的星形膠質(zhì)細(xì)胞(特異性抗GFAP免疫化學(xué)鑒定)；(2)MTT法檢測(cè)各代細(xì)胞對(duì)NaF毒性的敏感性；(3)顯微鏡觀察法、MTT法、FCM確定NaF染毒劑量范圍；(4)采用倒置顯微鏡觀察和FCM檢測(cè)的方法，觀察

2、不同時(shí)間點(diǎn)(12h、24h、48h、72h)不同濃度NaF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞周期構(gòu)成比；(5)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)SDH、5’-NT、ACP活性。 結(jié)果:(1)星形膠質(zhì)細(xì)胞傳代數(shù)超過(guò)8代后對(duì)毒物的敏感性明顯下降，故宜采用第8代以?xún)?nèi)細(xì)胞作NaF毒理學(xué)研究；(2)NaF抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：影響細(xì)胞周期構(gòu)成比呈時(shí)效(P<0.01)和量效關(guān)系(P<0.05)：(3)倒置顯微鏡下觀察，2mmol/L，及以上劑量處

3、理細(xì)胞12h后，細(xì)胞逐漸由貼壁而脫落，呈明顯的劑量和時(shí)間依賴(lài)性；吉姆．瑞氏染色后，可見(jiàn)細(xì)胞膜連接中斷，胞漿空泡，細(xì)胞膜皺縮，出芽現(xiàn)象，核膜不規(guī)則，核的染色質(zhì)呈現(xiàn)固縮，并在核膜上結(jié)成均質(zhì)的致密小塊，形成典型的結(jié)節(jié)狀、串珠狀或半月形廓，可見(jiàn)核小體，細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)特征，且凋亡細(xì)胞隨劑量增加和時(shí)間延長(zhǎng)而增多；(4)FCM分析細(xì)胞周期顯示：各時(shí)間點(diǎn)處理細(xì)胞隨染毒劑量加大和時(shí)間延長(zhǎng)，subGl細(xì)胞逐漸增多(時(shí)效P<0.01；量效P<0.05

4、)；1～5mmol/LNaF劑量范圍內(nèi)12h時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞隨劑量增加由GJM期阻滯(P<0.01)向S期阻滯(P<0.01)轉(zhuǎn)變；作用時(shí)間超過(guò)12h，1～2mmol/L范圍內(nèi)也可誘導(dǎo)細(xì)胞由G<,2>/M阻滯(P<0.01)向S期阻滯(P<0.001)轉(zhuǎn)變，且呈時(shí)間依賴(lài)性；增加劑量，則主要為subG<,1>細(xì)胞；(5)NaF抑制SDH(P<0.001)、ACP(P<0.001)活性，對(duì)5’-NT活性影響不明顯(P>0.1)；5’-NT、SDH

5、、ACP活性與subGl DNA相對(duì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)(SDH：r=-0.84148 P<0.02；ACP：r=-0.90416 P<0.01)。 結(jié)論: (1)采用大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞探討NaF的毒性機(jī)制，宜選擇傳第8代以?xún)?nèi)細(xì)胞：本實(shí)驗(yàn)首次以體外培養(yǎng)大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞為研究模型，觀察NaF對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性作用； (2)NaF誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)與劑量和時(shí)間有關(guān)； (3)NaF可以抑制星