TAZ通過(guò)影響放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的增殖周期來(lái)調(diào)節(jié)大腦皮層發(fā)育.pdf

1、目的：哺乳動(dòng)物的大腦皮層是由I-VI層特異性錐體神經(jīng)元組成的多層結(jié)構(gòu)，這些神經(jīng)元是由腦室區(qū)域的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞（Radial glial cells，RGCs）經(jīng)過(guò)不對(duì)稱分裂產(chǎn)生的，并且它們的產(chǎn)生以及遷移有一個(gè)明確的時(shí)間順序和空間排布。大腦皮層神經(jīng)元的生成是一個(gè)由內(nèi)而外的生成模式：早期生成的神經(jīng)元經(jīng)過(guò)遷移位于皮層深層，而晚期生成的神經(jīng)元定位在皮層淺層。但目前調(diào)控皮層神經(jīng)元產(chǎn)生的分子機(jī)制尚不是很清楚。Transcriptional coac

2、tivator with PDZ-binding motif（TAZ），是一個(gè)基于PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子，其通過(guò)調(diào)控干細(xì)胞的增殖、分化與凋亡參與干細(xì)胞的分化和多器官的形成。本論文主要探索 TAZ在大腦皮層發(fā)育中的調(diào)控作用。
　　方法：⑴收集C57/BL6小鼠胚胎各時(shí)期（E12、E14、E16、E18）及P0（出生當(dāng)天）的腦組織冰凍切片，利用免疫熒光染色及Western blot技術(shù)檢測(cè)TAZ在皮層的表達(dá)位置及表達(dá)水平的情況

3、。⑵TAZ-/-胎鼠腦體積與同窩TAZ+/+胎鼠腦體積的對(duì)比，檢測(cè)敲除TAZ對(duì)大腦體積的影響。⑶通過(guò)免疫熒光染色的方法，用放射狀膠質(zhì)細(xì)胞（RGCs）marker（Pax6）檢測(cè)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的變化情況，用中間前體細(xì)胞（IPCs）marker（Tbr2）來(lái)檢測(cè)中間前體細(xì)胞的變化情況。⑷5-溴-2′-脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2′-deoxyuridine; BrdU）可以標(biāo)記正在進(jìn)行DNA復(fù)制的細(xì)胞，用它的相應(yīng)抗體BrdU通過(guò)免疫熒

4、光的方法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖情況，用處在細(xì)胞周期中的細(xì)胞的標(biāo)志蛋白Ki67以及有絲分裂期的標(biāo)志蛋白PH3（Phospho-histone H3）通過(guò)免疫熒光染色再次檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖情況。⑸用Pax6/Tbr2分別和BrdU雙標(biāo)，檢測(cè)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞和中間前體細(xì)胞的增殖情況。⑹用BrdU和Ki67雙標(biāo)的免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期出口以及S期的長(zhǎng)度。⑺用皮層各層神經(jīng)元的特異性蛋白Tbr1（標(biāo)記第VI神經(jīng)元）、Ctip2（標(biāo)記第V層神經(jīng)元）以

5、及Cux1（標(biāo)記II-IV層神經(jīng)元）通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)各層神經(jīng)元的變化情況。用星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白GFAP、BLBP通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化。
　　結(jié)果：①TAZ在E12至P0各個(gè)時(shí)期均在小鼠腦組織中有表達(dá)，且表達(dá)水平隨胚胎年齡增高呈逐漸上升趨勢(shì)。②TAZ基因敲除導(dǎo)致小鼠大腦體積減小。③TAZ基因敲除導(dǎo)致RGCs細(xì)胞數(shù)目增加。④TAZ基因敲除引起RGCs細(xì)胞周期S期增長(zhǎng)、細(xì)胞周期出口的降低，從而促進(jìn)RGCs的增殖。