RUNX1T1在海馬放射狀膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元分化中的作用.pdf

1、RUNX1T1又稱為MTG8或ETO，作為重要的轉(zhuǎn)錄因子參與各個系統(tǒng)的發(fā)育調(diào)控。目前，RUNX1T1在白血病發(fā)病機制方面的研究較多，而在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用研究甚少，主要認為該因子可作為共抑制子參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中細胞的增殖和向神經(jīng)元分化。為研究RUNX1T1在海馬神經(jīng)再生中調(diào)控海馬放射狀膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元分化的作用，本研究主要探討RUNX1T1在海馬神經(jīng)再生中所起的作用。
　　一目的：
　　觀察海馬神經(jīng)再生微環(huán)境刺激下，“激活

2、”的星形膠質(zhì)細胞自身發(fā)生的變化及對海馬神經(jīng)再生的影響；觀察切割穹窿海馬傘海馬中RUNX1T1 mRNA和蛋白表達的時相變化及其定位；體外模擬海馬神經(jīng)再生微環(huán)境，觀察海馬放射狀膠質(zhì)細胞表達RUNX1T1以及向神經(jīng)元分化情況；體外沉默和過表達RUNX1T1后對海馬放射狀膠質(zhì)細胞分化為神經(jīng)元的影響；體內(nèi)沉默和過表達 RUNX1T1后對海馬神經(jīng)再生的影響，明確RUNX1T1與海馬神經(jīng)再生的關(guān)系。
　　二方法：
　?。?）切割大鼠雙側(cè)

3、穹窿海馬傘并且制備正常及切割穹窿海馬傘海馬提取液；
　?。?）體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)膠質(zhì)，在培養(yǎng)液中加入正常及切割穹窿海馬傘海馬提取液，“激活”星形膠質(zhì)膠質(zhì)，檢測其共表達BLBP、Vimentin、Nestin、Sox2與GFAP的情況；
　　（3）制備“激活”的星形膠質(zhì)膠質(zhì)條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)海馬NSCs，檢測NSCs的存活、遷移和分化為神經(jīng)元的情況；
　　（4）ELISA檢測條件培養(yǎng)基中聚集素蛋白（Clusterin，CLU

4、）的含量，體外檢測Clusterin蛋白誘導(dǎo)海馬NSCs向神經(jīng)元分化的情況；
　　（5）制備切割右側(cè)穹窿海馬傘大鼠模型，分別于術(shù)后第3d、7d、14d、21d、28d檢測RUNX1T1 mRNA和蛋白表達情況；
　　（6）體外培養(yǎng)海馬 RGCs，在培養(yǎng)液中加入正常和切割海馬提取液，觀察海馬提取液促進RGCs表達RUNX1T1以及向神經(jīng)元分化的作用；
　?。?）將siRNA-RUNX1T1干擾慢病毒和LV-RUNX1T1

5、-overexpression過表達慢病毒分別轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的海馬RGCs中，檢測海馬RGCs中RUNX1T1 mRNA和蛋白表達，以及向神經(jīng)元分化情況；
　?。?）將siRNA-RUNX1T1干擾慢病毒注入切割穹窿海馬傘大鼠海馬齒狀回中，觀察海馬齒狀回中新生DCX陽性神經(jīng)元的情況；
　?。?）將LV-RUNX1T1-overexpression過表達慢病毒注入正常大鼠海馬齒狀回中，觀察海馬齒狀回中新生DCX陽性神經(jīng)元的情況

6、。
　　三結(jié)果：
　　（1）切割穹窿海馬傘大鼠海馬提取液“激活”的星形膠質(zhì)細胞，膠質(zhì)前體細胞的標記物BLBP、Vimentin和神經(jīng)干細胞的標記物Nestin、Sox2表達顯著增強，出現(xiàn)較多的Nestin+/GFAP+細胞和Sox2+/GFAP+細胞；
　?。?）“激活”星形膠質(zhì)細胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的海馬神經(jīng)干細胞球，球內(nèi)細胞的存活和發(fā)育狀態(tài)明顯較好；在膜穿孔實驗中，用“激活”星形膠質(zhì)細胞的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)干細

7、胞，其發(fā)生遷移的數(shù)量顯著較多；并出現(xiàn)更多數(shù)量的海馬神經(jīng)干細胞分化成MAP-2陽性神經(jīng)元，且神經(jīng)元的突起也長而豐富；
　?。?）對制備的各組條件培養(yǎng)基進行ELISA檢測，結(jié)果顯示切割組12h、24h、48h中的 Clusterin蛋白濃度均明顯高于對照組和正常組，其中切割24h組達到它們的4倍；利用Clusterin在體外誘導(dǎo)海馬神經(jīng)干細胞分化，觀察到Clusterin能明顯促進更多的海馬神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化，并且分化的神經(jīng)元與空

8、白對照組相比，其突起更長、更豐富；
　　（4）切割穹窿海馬傘后不同時間點，海馬組織中RUNX1T1的表達水平發(fā)生了變化，在切割3d組中RUNX1T1 mRNA和蛋白的表達明顯上調(diào)，并達到高峰，此后迅速下降；免疫熒光檢測進一步顯示，在海馬齒狀回中RUNX1T1陽性細胞主要分布于顆粒下層，在正常組中僅見少量的 RUNX1T1陽性細胞，切割3d組中 RUNX1T1陽性細胞數(shù)迅速增加，并達到高峰，在7d組，RUNX1T1陽性細胞數(shù)逐漸減少

9、，21d組，基本恢復(fù)到正常水平；
　　（5）用切割穹窿海馬傘海馬提取液培養(yǎng)海馬RGCs，體外模擬海馬再生微環(huán)境，結(jié)果觀察到“激活”的海馬RGCs中RUNX1T1 mRNA和蛋白的表達量均明顯上調(diào)，分別約為2.9倍和2.4倍，并且更多的海馬RGCs可向MAP-2陽性神經(jīng)元分化；
　　（6）在RUNX1T1-RNAi有效地下調(diào)海馬RGCs中RUNX1T1的表達后，觀察到僅有3.20％±2.31%細胞分化成 MAP-2陽性神經(jīng)元，

10、明顯少于對照組和空病毒組，而且細胞突起也明顯較短、較少。相反，用過表達慢病毒LV4-RUNX1T1-overexpression轉(zhuǎn)染海馬 RGCs，上調(diào)海馬 RGCs中 RUNX1T1的表達，28.31%±5.05%細胞表達MAP-2，與對照組和空病毒組相比，陽性細胞數(shù)量明顯明顯增多，細胞突起顯著變長而豐富；
　?。?）將構(gòu)建的siRNA-RUNX1T1干擾慢病毒載體注入切割穹窿海馬傘海馬齒狀回中，檢測到海馬中RUNX1T mRN

11、A及蛋白的表達顯著下調(diào)，海馬齒狀回中新生的DCX陽性神經(jīng)元數(shù)也明顯減少；而在正常海馬齒狀回中注射LV-RUNX1T1過表達慢病毒載體，上調(diào)RUNX1T mRNA及蛋白的表達，則觀察到更多的新生DCX陽性神經(jīng)元，細胞的突起更長更豐富。
　　四結(jié)論：
　?。?）切割穹窿海馬傘大鼠海馬提取液“激活”的星形膠質(zhì)細胞，高表達膠質(zhì)前體細胞標記物和神經(jīng)干細胞標記物，逆轉(zhuǎn)化成放射狀膠質(zhì)細胞，具有胚胎源性；
　　（2）“激活”的星形膠質(zhì)

12、細胞可促進海馬神經(jīng)干細胞存活、遷移和向神經(jīng)元分化；
　?。?）“激活”的星形膠質(zhì)細胞分泌更多的 Clusterin蛋白，從而促進海馬神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化；
　?。?）穹窿海馬傘切割后海馬內(nèi)RUNX1T1 mRNA和蛋白表達在早期呈短暫性上調(diào)，并定位于海馬齒狀回顆粒下層；
　?。?）切割穹窿海馬傘海馬提取液促進RGCs上調(diào)RUNX1T1和向神經(jīng)元分化
　?。?）體外下調(diào)RGCs中RUNX1T1的表達，可抑制RGC