CIC-3氯通道在SIN-1誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元凋癖好中的作用.pdf

1、目的：觀察CIC-3氯通道在一氧化氮(NO)供體SIN-1誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡過(guò)程中的表達(dá)，探討氯通道在缺血性腦損傷中的作用。
　　 方法：采用培養(yǎng)12天的SD大鼠海馬神經(jīng)元，隨機(jī)分為Control組、SIN-1組和SIN-1+DIDS組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)時(shí)，SIN-1的作用時(shí)間是18小時(shí)；SIN-1+DIDS組中，DIDS與SIN-1同時(shí)加入培養(yǎng)基中，作用18小時(shí)。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率、Hoechst33342熒光

2、染色和caspase-3凋亡蛋白測(cè)定檢測(cè)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞免疫熒光染色、免疫印跡和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CIC-3氯通道的表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)SIN-1誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡具有濃度依賴性，隨SIN-1濃度的增加其誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的作用明顯增強(qiáng)。0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、2.0mmol/L濃度的SIN-1細(xì)胞生存率分別為101.10±1.66％、88.60±2.01％、72.59±3.31％、69.52±1.00％、57.

3、89±1.98％、44.30±2.66％、11.84±0.66％，0.2-2.0mmol/L各組與0mmol/L組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001，n=6)。1.0mmol/L的SIN-1可顯著誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生凋亡，在之后實(shí)驗(yàn)中采用此濃度建立神經(jīng)元凋亡的模型。(2)氯通道阻斷劑DIDS呈濃度依賴性提高細(xì)胞生存率，抑制SIN-1誘導(dǎo)培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的損傷作用。正常組的細(xì)胞生存率是100.20±0.92％，0、10、50、100、20

4、0、300μmol/L濃度的DIDS細(xì)胞生存率分別為58.99±3.70％、76.36±1.22％、73.74±0.93％、86.26±1.26％、78.79±1.60％、68.69±1.27％，10-200μmol/L各組與0μmol/L組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001，n=6)，在之后實(shí)驗(yàn)中DIDS均采用100μmol/L濃度。(3)Hoechst33342對(duì)神經(jīng)元核染色顯示，正常組中神經(jīng)元胞核呈卵圓形或錐形，呈淡藍(lán)色熒光，凋亡

5、發(fā)生率為5.56±0.81％；SIN-1(1.0mmol/L)組中神經(jīng)元胞核濃縮、變小，呈強(qiáng)亮色熒光，凋亡發(fā)生率為51.06±2.38％，與Control組相比具有顯著性差別(P<0.001，n=6)；SIN-1+DIDS(100μmol/L)組的細(xì)胞凋亡發(fā)生率為21.61±1.36％，與SIN-1組相比具有顯著性差別(P<0.001，n=6)。(4)細(xì)胞免疫熒光染色顯示，正常培養(yǎng)12天的海馬神經(jīng)元細(xì)胞膜上CIC-3氯通道的表達(dá)呈陽(yáng)性；

6、而在SIN-1(1.0mmol/L)誘導(dǎo)的凋亡神經(jīng)元細(xì)胞膜上CIC-3氯通道的表達(dá)增強(qiáng)；SIN-1+DIDS(100μmol/L)組中CIC-3氯通道表達(dá)減弱。(5)Western blot結(jié)果顯示，Control組中CIC-3蛋白相對(duì)表達(dá)量是0.37±0.07；SIN-1(1.0mmol/L)組中CIC-3蛋白相對(duì)表達(dá)量是1.73±0.24，與Control組相比具有顯著性差別(P<0.001，n=6)；SIN-1+DIDS組中CIC

7、.3蛋白相對(duì)表達(dá)量是0.99±0.18，與SIN-1組相比具有顯著性差別(P<0.001，n=6)。(6)real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Control組中CIC-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量是0.33±0.11；SIN-1(1.0mmol/L)組中CIC-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量是11.99±4.76，與Control組相比，P<0.05(n=3)；SIN-1+DIDS組中CIC-3mRNA相對(duì)表達(dá)量是6.23±1.17，與SIN-1