自噬在異氟醚致幼齡大鼠海馬神經(jīng)元凋亡中的作用.pdf

1、異氟醚是臨床常用的吸入麻醉劑，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)異氟醚可誘發(fā)快速生長發(fā)育期動(dòng)物的大腦神經(jīng)元異常凋亡，并伴隨有腦功能的長期損害。本課題組多年來一直致力于異氟醚神經(jīng)毒性方面的研究，在異氟醚引發(fā)幼鼠行為學(xué)改變、誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡等方面獲得了較多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。近期又發(fā)現(xiàn)異氟醚在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)伴有自噬現(xiàn)象發(fā)生。自噬和凋亡的復(fù)雜關(guān)系是當(dāng)今研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)問題，明確自噬在異氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用及相關(guān)機(jī)制，將為進(jìn)一步探討麻醉毒性及其機(jī)制提供

2、理論基礎(chǔ)。因此本試驗(yàn)以7日齡Sprague-Dawley(SD)大鼠為研究對象，結(jié)合自噬工具藥的運(yùn)用，明確自噬在異氟醚致幼鼠海馬凋亡中的作用，并初步探討異氟醚引起的凋亡與自噬之間的關(guān)系。
　　試驗(yàn)選取120只7日齡SD大鼠，隨機(jī)分為異氟醚(Isoflurane)麻醉組(ISO)、雷帕霉素(rapamycin，RAP)干預(yù)組（ISO+RAP）和3-甲基嘌呤(3-methyladenine，3-MA)干預(yù)組(ISO+3-MA)。ISO

3、+RAP組和ISO+3-MA組在麻醉前30 min分別腹腔注射20 mg/kg RAP和20 mg/kg3-MA。各組大鼠分別吸入1.5％異氟醚混合60％氧氣0 h(CON)、2h、3h、4h和6h，CON組只吸入60％氧氣6h。采用蘇木精-伊紅(HE)染色、原位末端標(biāo)記法(TUNEL)染色、免疫組化和蛋白印跡法(Western blot)等技術(shù)，從組織學(xué)和分子學(xué)角度探討異氟醚誘導(dǎo)的自噬和凋亡之間的關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　HE染

4、色發(fā)現(xiàn)，對照組海馬各區(qū)神經(jīng)細(xì)胞元排列緊密，少有凋亡;ISO組在麻醉3h后出現(xiàn)較明顯凋亡;ISO+RAP組在麻醉4h后出現(xiàn)較明顯凋亡;ISO+3-MA組在各麻醉時(shí)間點(diǎn)均出現(xiàn)不同程度凋亡，在麻醉4h和6h時(shí)尤為嚴(yán)重。TUNEL染色顯示:與對照組比，ISO組在麻醉3h后凋亡明顯增加;ISO+3-MA組在麻醉2h后均有明顯凋亡;ISO+RAP組僅在麻醉4h和6h時(shí)有明顯凋亡。組間比較，ISO+RAP組在麻醉4h（P＜0.05）和6h(P＜0.0

5、5)時(shí)較ISO組細(xì)胞凋亡率顯著降低;ISO+3-MA組在麻醉2h(P＜0.05)、3h(P＜0.05)和4h(P＜0.05)時(shí)較ISO組細(xì)胞凋亡率顯著增多。Cleaved-caspase-3蛋白印跡結(jié)果與TUNEL染色結(jié)果基本一致。LC-3Ⅱ免疫組化顯示:與對照組相比，ISO組在麻醉3h時(shí)陽性細(xì)胞比率較多;ISO+3-MA組LC-3Ⅱ陽性細(xì)胞比率較低，但在麻醉6h時(shí)明顯增加;ISO+RAP組則在麻醉3h和4h時(shí)有較多陽性細(xì)胞表達(dá)。LC-

6、3Ⅱ蛋白結(jié)果顯示:與對照組相比，ISO組在麻醉3h后表達(dá)量顯著增加;ISO+3-MA組在各麻醉時(shí)間點(diǎn)均無顯著變化;ISO+RAP組在麻醉2h、3h和4h時(shí)顯著升高。組間比較，ISO+RAP組在麻醉2h時(shí)表達(dá)量明顯高于ISO組(P＜0.05)，在麻醉2h(P＜0.05)和3h(P＜0.05)時(shí)顯著高于ISO+3-MA組。Beclin-1變化趨勢與LC-3Ⅱ基本一致。Bcl-2蛋白印跡結(jié)果顯示:與對照組相比，ISO組和ISO+3-MA組在麻

7、醉3h后均有顯著下降;ISO+RAP組僅在麻醉4h和6h時(shí)顯著下降。組間相比，ISO組和ISO+3-MA組在麻醉3h(P＜0.05，P＜0.05)，4h(P＜0.05，P＜0.05)和6h(P＜0.05，P＜0.05)時(shí)均顯著低于ISO+RAP組;在麻醉2h時(shí)，ISO+3-MA組Bcl-2表達(dá)量顯著低于ISO+RAP組(P＜0.05)和ISO組(P＜0.05)。
　　本試驗(yàn)結(jié)果顯示，1.5％異氟醚可誘發(fā)7日齡SD大鼠海馬神經(jīng)元發(fā)生