NAP對匹魯卡品致癇大鼠海馬神經元的保護作用.pdf

1、癲癇(epilepsy)是神經系統(tǒng)常見疾病，嚴重危害人類健康，給社會、家庭和個人都帶了來沉重的負擔，我國目前約有900萬癲癇患者，患病率為5‰～7‰，其中約有20％-40％的患者用現(xiàn)有的抗癲癇治療方法不能很好地控制發(fā)作，演變?yōu)殡y治性癲癇，顳葉癲癇(temporallobeepilepsy,TLE)是其中最常見的類型。近年來對對TLE的病因、病理及發(fā)病機制的研究取得了巨大進展，但其發(fā)病機制目前尚未完全闡明，藥物及手術治療均難以取得明顯療效

2、。氯化鋰一匹羅卡品致癇大鼠行為學、神經電生理學和海馬神經元損傷的病理學改變均與人類顳葉癲癇相似，因此是目前研究癲癇持續(xù)狀態(tài)(statusepilepticus，SE)和TLE的常用模型之一。反復癲癇發(fā)作能造成神經元損傷已被廣泛認可，但癲癇發(fā)作致神經元損傷的分子生物學機制目前仍不十分清楚。因此進一步探討癲癇的病因及發(fā)病機制，探索新的神經保護藥物及潛在作用機制，具有重要的理論和現(xiàn)實意義。
　　 NAP(napvsipq)是一種人工合

3、成的辛肽化合物，是活性依賴性神經保護蛋白（activity-dependentneuroprotectiveprotein,ADNP）的活性肽段[1-4]，它的發(fā)現(xiàn)源于對血管活性腸肽(vasoactiveintestinalpeptide,VIP)的研究[5，6]，后者是一種肽能神經遞質，可以刺激神經膠質細胞分泌神經營養(yǎng)素包括ADNP。NAP已經被證實在極低濃度（毫克每千克體重）即具有很強的生物活性，它可以對抗由β淀粉樣蛋白(Aβ)、興

4、奮性毒素NMDA、電阻滯、HIV衣殼蛋白(GP120)、多巴胺、H2O2和鋅超載等所引起的細胞損傷;NAP還可以保護ApoE敲除的大鼠、閉合性腦損傷、胎兒酒精中毒和中風的大鼠的大腦神經元免受損傷[7,8]，在不可逆的局部腦缺血模型中，發(fā)現(xiàn)應用NAP可以減少梗死面積，顯著降低凋亡神經元數(shù)目[9]。近年來，對NAP的神經保護作用機制的研究也日益深入，有研究提示NAP可以通過介導線粒體凋亡途徑發(fā)揮神經保護作用。
　　 NAP具有抗凋亡

5、及神經保護作用已被廣泛認可，但其是否能在癲癇引起的腦損傷中發(fā)揮保護作用目前研究甚少。因此，本課題建立氯化鋰—匹羅卡品致癇大鼠模型，探討癲癇發(fā)作后海馬神經元損傷的病理學特征及分子生物學改變;檢測腹腔給予外源性NAP對匹羅卡品致癇后大鼠海馬神經元線粒體凋亡通路相關蛋白水平的變化及氧化應激水平的改變，深入探討NAP對癲癇發(fā)作后海馬神經元是否具有保護作用及其可能的機制。本研究分兩個部分:
　　 第一部分:
　　 氯化鋰-匹魯卡品

6、大鼠急性癲癇模型的建立及對海馬神經元損傷的病理學和分子學觀察
　　 目的:
　　 1.建立氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)的大鼠顳葉癲癇的模型。
　　 2.觀察氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠行為學及海馬組織病理學改變。
　　 3.研究氯化鋰-匹羅卡品致癇后不同時間點大鼠海馬線粒體凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和活性caspase-3水平的變化，進一步探討癲癇后大鼠海馬神經元損傷的分子生物學機制。
　　 4.研究氯化

7、鋰-匹魯卡品致癇后不同時間點大鼠海馬氧化應激水平的改變。
　　 方法:
　　 1.健康成年雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組、癲癇組，后者又分為癲癇發(fā)作后2h、6h、16h、24h和72h組
　　 2.癲癇組大鼠腹腔注射氯化鋰-匹羅卡品誘發(fā)SE，觀察大鼠行為學改變，SE持續(xù)60min后腹腔注射地西泮終止發(fā)作。
　　 3.癲癇組各組部分大鼠在相應的時間點斷頭取腦，分離海馬，提取蛋白，Westernblo

8、t法檢測各組大鼠海馬Bax、Bcl-2和活性caspase-3的水平。
　　 4.癲癇組各組剩余大鼠在相應的時間點斷頭取腦，分離海馬，制成細胞懸液，酶標儀測細胞氧化應激水平。
　　 5.癲癇發(fā)作后24h組，用多聚甲醛灌注取腦，石蠟包埋、切片，HE和Nissl染色觀察大鼠海馬神經元損傷情況，脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediatedd

9、UTPnickend-labeling,TUNEL)法檢測細胞凋亡。
　　 結果:
　　 1.根據(jù)Racine發(fā)作評分標準，發(fā)作達到Ⅳ-Ⅴ級的大鼠被認為是誘發(fā)SE成功（表現(xiàn)為雙側前肢的陣攣、抽搐及全面性強直.陣攣發(fā)作，雙側后肢強直伴身體直立、軀干背曲強直、跌倒）。氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)大鼠SE成功率為89.3％，潛伏期39.5+18.6min。
　　 2.HE和Nissl染色顯示:正常大鼠海馬CA1和CA3區(qū)錐體細

10、胞排列整齊，細胞結構清晰完整，細胞核結構正常，染色質分布均勻，胞漿內尼氏小體豐富;癲癇組大鼠海馬的CA1和CA3區(qū)部分神經元丟失，排列疏松，細胞輪廓模糊，細胞結構不清，部分神經元胞體皺縮，核固縮，胞漿深染，胞漿內尼氏小體減少。
　　 3.正常組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)TUNEL染色未見陽性細胞，癲癇組大鼠在SE后24hTUNEL染色陽性細胞較正常組大鼠明顯增加((P)＜0.05)。
　　 4.較正常組相比，癲癇組大鼠海馬

11、Bax的表達顯著增高(p＜0.05），而Bcl-2的水平則明顯降低(p＜0.05）;癲癇發(fā)作早期caspase-3無活性，直到癲癇發(fā)作后24hcaspase-3才被激活(p＜0.05)。
　　 5.SE細胞內ROS水平升高，3h升高明顯，6h達到高峰
　　 結論:
　　 根據(jù)氯化鋰-匹魯卡品腹腔注射后大鼠的行為學改變說明氯化鋰-匹魯卡品腹腔注射可致大鼠急性癲癇發(fā)作（即SE），氯化鋰-匹魯卡品致癇后可以引起大鼠海馬

12、神經元的損傷、細胞內氧化應激水平的改變和細胞凋亡，細胞凋亡可以通過調節(jié)線粒體凋亡途徑引起。本研究闡明了癲癇后海馬神經元損傷的可能分子生物學機制，為進一步研究癲癇的神經保護治療提供理論依據(jù)。
　　 第二部分:
　　 神經保護多肽NAP對氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬神經元的保護作用
　　 目的:
　　 研究神經保護肽NAPVSIPQ對氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬神經元線粒體凋亡相關蛋白表達水平和細胞內氧化應激

13、水平的影響，進一步探討NAPVSIPQ對癲癇后海馬神經元的保護作用及其可能的機制
　　 方法:
　　 1.成年雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組、匹魯卡品組、匹魯卡品+生理鹽水組和匹魯卡品+NAP組，觀察各組大鼠的行為學差異。
　　 2.癲癇發(fā)作后24h灌注取腦、Nissl染色觀察各組大鼠海馬神經元損傷情況，并且測定海馬CA1和CA3區(qū)神經元存活數(shù)。
　　 3.癲癇發(fā)作后24h斷頭取腦，分離海馬，We

14、sternblot法測定各組海馬Bax、Bcl-2和活性caspase-3的水平。
　　 4.癲癇發(fā)作后24h斷頭取腦，分離海馬，酶標儀檢測各組海馬細胞內氧化應激水平。
　　 結果:
　　 1.NAP對匹魯卡品誘發(fā)的大鼠癲癇發(fā)作潛伏期、發(fā)作程度及急性期死亡率沒有明顯影響。
　　 2.Nissl染色顯示正常大鼠海馬CA1和CA3區(qū)細胞結構排列整齊緊密，細胞結構清晰，細胞核結構清晰，染色質分布均勻，胞漿內尼氏

15、小體豐富。癲癇發(fā)作后24h大鼠海馬CA1和CA3區(qū)細胞排列紊亂、部分神經元丟失，胞質濃縮，核固縮，染色質分布不均，胞質內尼氏小體減少。NAP干預的大鼠海馬CA1和CA3區(qū)細胞結構完整，少量細胞出現(xiàn)染色質凝集現(xiàn)象。較正常對照組，癲癇發(fā)作后24h神經元存活數(shù)明顯減少(p＜0.05)，而NAP顯著減少了癲癇導致的神經元丟失(p＜0.05)，而匹魯卡品組和匹魯卡品+生理鹽水組神經元存活數(shù)無明顯差異。
　　 3.與匹魯卡品組相比，NAP+

16、匹魯卡品組大鼠海馬Bcl-2水平明顯升高(p＜0.05)，而Bax和活性caspase-3水平顯著降低(p＜0.05)。匹魯卡品+生理鹽水組上述指標水平與匹魯卡品組無明顯差異。
　　 4.與匹魯卡品組相比，NAP預注射組大鼠SE6h后海馬氧化應激水平明顯降低(p＜0.05)。
　　 結論:
　　 NAPVSIPQ可以上調Bcl-2/Bax水平，抑制caspase-3的激活，從而通過抑制線粒體凋亡途徑抑制氯化鋰-匹

17、魯卡品致癇大鼠癲癇發(fā)作后海馬神經元凋亡，同時可以降低細胞內氧化應激水平，減輕氧化應激損傷，從而減輕癲癇導致的海馬神經元損傷，也為癲癇后神經元保護治療提供新的治療靶點。
　　 研究意義:
　　 本研究用氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作作為顳葉癲癇的大鼠模型，深入研究了線粒體凋亡通路和氧化應激損傷在癲癇發(fā)作導致致的海馬神經元損傷中所起的作用，第一次證實了ADNF活性神經短肽NAPVSIPQ在氯化鋰-匹魯卡品所致的癲癇中通過調