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文檔簡介
1、腦血管疾病是因顱內(nèi)血液循環(huán)障礙而造成腦組織損害的一組疾病,臨床上以急性發(fā)病居多,分為出血性和缺血性兩類,其中缺血性疾病更占多數(shù)。局灶性腦缺血和全腦缺血都是圍術期嚴重的并發(fā)癥。局灶性腦卒中治療的重點是腦缺血半暗帶,而發(fā)生全腦缺血時最敏感的區(qū)域是海馬。腦缺血導致的神經(jīng)細胞損傷,在缺血部位恢復血液灌注后,其損傷進一步加重,稱之為腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury)。其發(fā)病機制復雜,涉及能
2、量代謝障礙,細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡,氧化應激,炎癥損傷及細胞凋亡等等。這些環(huán)節(jié)相互聯(lián)系,相互激發(fā),形成快速級聯(lián)反應,迅速加重損傷。
近年來,大量研究顯示異氟醚預處理對腦缺血再灌注損傷有保護作用,但是其確切機制尚不清楚。以往研究認為異氟醚預處理抑制了腦缺血再灌注過程中的炎性反應,而Toll樣受體4(Toll like receptors,TLR4)屬于先天性免疫細胞中的跨膜受體及病原模式識別受體,在急性炎癥反應中調(diào)節(jié)細胞吞噬作用,以及
3、在細胞信號轉導和細胞凋亡中起重要作用。有研究表明TLR4參與了腦缺血再灌注損傷時神經(jīng)細胞的凋亡,那么異氟醚預處理是否參與了該途徑而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究針對這一問題進行了進一步研究,為異氟醚預處理和腦保護研究提供新的理論和實驗依據(jù)。
第一部分異氟醚預處理對小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用
目的:明確異氟醚預處理是否影響局灶性腦缺血損傷時缺血半暗帶區(qū)域TLR4的表達。
方法:健康雄性C57BL/6小鼠3
4、0只,隨機分為3組(n=10)。假手術組(sham組):只分離血管,不進行其余操作。局灶性腦缺血再灌注組(I/R組):制備右側大腦中動脈阻塞(Middle Cerebral Arterial Occlusion,MCAO)模型,60min后拔出線栓,恢復血供24h。異氟醚預處理組(ISO組):使用1.5%異氟醚預處理2h,24h后制作MCAO模型,60min后拔出線栓,恢復血供24h。通過Western Blot法檢測各組小鼠右側腦缺血
5、半暗帶區(qū)域TLR4和LAMP2A的表達情況。
結果:Western Blot法檢測顯示,與sham組比較,I/R組和ISO組受到缺血再灌注損傷,缺血半暗帶TLR4蛋白和LAMP2A表達顯著增高,p<0.05;而與 I/R組比較,ISO組接受異氟醚預處理,其缺血半暗帶 TLR4和 LAMP2A蛋白表達降低,有統(tǒng)計學意義,p<0.05。
結論:異氟醚預處理降低小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷時腦缺血半暗帶區(qū)域TLR4和LAMP
6、2A蛋白的表達。
第二部分異氟醚預處理對小鼠全腦缺血再灌注損傷的保護作用
目的:明確異氟醚預處理是否影響全腦缺血再灌注損傷時海馬區(qū)域和皮層神經(jīng)細胞TLR4和LAMP2A的表達。
方法:健康雄性 C57BL/6小鼠30只,隨機分為3組(n=10)。假手術組(sham組):只分離血管,不進行其余操作。全腦缺血再灌注組(I/R組):夾閉雙側頸動脈制作全腦缺血模型,10min后開放雙側頸動脈,恢復大腦血供。異氟醚預
7、處理組(ISO組):使用1.5%異氟醚預處理2h,24h后制作全腦缺血模型,10min后開放雙側頸動脈,恢復大腦血供。24h后,通過Western Blot法檢測各組小鼠海馬區(qū)TLR4和LAMP2A蛋白表達的情況。
結果:Western Blot法檢測顯示,與sham組比較,I/R組和ISO組受到缺血再灌注損傷,海馬區(qū)TLR4和LAMP2A蛋白表達顯著增高,p<0.05;而與I/R組比較,ISO組接受異氟醚預處理,其海馬區(qū)TL
8、R4和LAMP2A蛋白表達降低,有統(tǒng)計學意義,p<0.05。
結論:異氟醚預處理降低小鼠全腦缺血再灌注損傷時海馬區(qū)TLR4和LAMP2A蛋白的表達。
第三部分異氟醚預處理對離體神經(jīng)元缺血再灌注損傷時TLR4和LAMP2A表達的影響
目的:明確異氟醚預處理對離體神經(jīng)元缺血再灌注損傷時TLR4和LAMP2A表達的影響。
方法:原代培養(yǎng)的神經(jīng)細胞隨機分為3組。對照組(sham組),細胞不經(jīng)任何處理;氧糖
9、剝奪組(OGD組),于神經(jīng)細胞接種第8天進行OGD處理2h,復氧復糖24h;異氟醚預處理組(ISO組),于神經(jīng)細胞接種第7天進行異氟醚預處理,24h后進行 OGD處理2h,復氧復糖24h。通過細胞免疫熒光染色和Western Blot法檢測神經(jīng)元TLR4和NF-κB的表達。
結果:細胞免疫組化染色顯示 OGD/R損傷可以造成神經(jīng)元 TLR4和LAMP2A表達增加,接受異氟醚預處理可以減少 OGD/R損傷后 TLR4和LAMP2
10、A的表達。Western Blot法測定各組TLR4和LAMP2A表達,也可以得到相同結果。
結論:異氟醚預處理降低離體神經(jīng)元缺血再灌注損傷時TLR4和LAMP2A的表達。
第四部分異氟醚預處理通過下調(diào)TLR4抑制神經(jīng)細胞凋亡和自噬
目的:研究異氟醚預處理對神經(jīng)細胞缺血再灌注損傷的保護作用及機制。方法:培養(yǎng)至對數(shù)生長期的PC12細胞,隨機分為5組:對照組(sham組),細胞不經(jīng)任何處理;氧糖剝奪模型組(OG
11、D組),進行OGD處理4h,復氧復糖24h;異氟醚預處理組(ISO pc+OGD,ISO組),進行異氟醚預處理后24h再進行OGD/R處理;TLR4抑制劑組(CLI-095+OGD,CLI-095組),進行OGD/R處理前24h給與TLR4抑制劑CLI-095;TLR4激動劑組(ISO pc+LPS+OGD, LPS組),細胞傳代后加入TLR4激動劑LPS,24h后進行異氟醚預處理2h,24h后再進行OGD/R處理。
通過 M
12、TT法檢測細胞存活數(shù),流式細胞技術檢測各組細胞凋亡率。通過Western Blot法檢測各組細胞TLR4、NF-κB和LAMP2A的表達。
結果:通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)與sham組相比,OGD組、ISO組、CLI-095組和LPS組OD值顯著降低。而與OGD組相比,ISO組和CLI-095組OD值增高。LPS組OD值與OGD組沒有顯著差異。
通過流式細胞技術檢測各組細胞的凋亡率,與sham組相比,OGD組、ISO組、CL
13、I-095組和LPS組PC12細胞凋亡率均增高,差異有統(tǒng)計學意義。而ISO組和CLI-095組的細胞凋亡率與OGD組相比較明顯下降,LPS組凋亡率與OGD組相比較無明顯差異。
使用Western Blot法測定各組PC12細胞的TLR4、NF-κB和LAMP2A蛋白表達,與sham組比較,OGD組、ISO組、CLI-095組和LPS組TLR4和NF-κB蛋白表達顯著增高;與OGD組比較,ISO組和 CLI-095組 TLR4、
14、NF-κB和LAMP2A蛋白表達顯著降低,而LPS組的蛋白表達無明顯差異。
結論:異氟醚預處理通過下調(diào)TLR4抑制神經(jīng)細胞凋亡和自噬對神經(jīng)細胞缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護作用。
在腦缺血再灌注損傷發(fā)生時除了炎性反應被激活,分子伴侶介導的自噬也被激活。異氟醚預處理可以抑制神經(jīng)元TLR4激活,而TLR4對CMA也具有一定的調(diào)控作用。表現(xiàn)為異氟醚預處理可以使LAMP2A的表達減少,而給與TLR4抑制劑后,LAMP2A表達相應增加
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