TRPC在SNP誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡中作用及機(jī)制的初步研究.pdf

1、研究背景: 一氧化氮(Nitricoxide，NO)在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，無論在生理狀態(tài)或病理狀態(tài)下，都是一個(gè)重要的信號(hào)分子[1]。生理狀態(tài)下低濃度NO可促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化等，而高濃度則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡甚至壞死[2]。在腦缺血缺氧損傷，氧化應(yīng)激等條件下，腦內(nèi)過量的NO表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性[3]。研究發(fā)現(xiàn)，NO通過阻斷線粒體氧化呼吸鏈、直接損傷DNA或啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)來誘導(dǎo)凋亡[4,5,6]。以往神經(jīng)元損傷研究已證實(shí)：細(xì)胞內(nèi)鈣離子在

2、上述通路中均起重要作用[7]。近年來，TRPC離子通道作為一類可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度非特異性陽離子通道[8]，其功能研究受到了廣泛關(guān)注。研究已表明，NO可激活TRPC離子通道并提高胞內(nèi)鈣離子濃度[9,10]。但TRPC離子通道是否因此參與NO誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡呢?本研究以體外原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元為研究對(duì)象，對(duì)TRPC是否參與NO誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡及其機(jī)制進(jìn)行初步探討，以期為神經(jīng)損傷的防治研究提供新線索。 目的: 本研究通過SNP自

3、發(fā)釋放NO，誘導(dǎo)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元凋亡，在此模型基礎(chǔ)上初步探討TRPC在凋亡中的作用及其機(jī)制，以期為神經(jīng)損傷的防治研究提供新思路。 方法: 原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元作為空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分為三組，分別為原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中加入SNP，SNP+TRPC通道阻斷劑組；SNP+TRPC通道激活劑組。細(xì)胞處理24h后MTT比色法檢測各組細(xì)胞存活率，Hoechest33342熒光染色觀察細(xì)胞凋亡。采用Trizol提取細(xì)胞中的總RNA，R

4、T-PCR檢測TRPC在海馬神經(jīng)元上的表達(dá)情況，real-timeRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測TRPC1以及凋亡相關(guān)基因mRNA水平的表達(dá)變化。 結(jié)果: 1.原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)及鑒定，通過RT-PCR檢測TRPC1-6，發(fā)現(xiàn)所有的TRPC亞型在海馬神經(jīng)元均有表達(dá)。 2.①SNP(1mM)處理24小時(shí)，神經(jīng)元存活率為67.4％；與空白對(duì)照組有顯著差異(P<0.01，n=9)，SNP+TRPC阻斷劑組(2-APB，SKF9

5、6365)神經(jīng)元存活率分別為102％、92.7％，與SNP組有顯著差異(P<0.01，n=8)；而SNP+TRPC激活劑(OAG)組神經(jīng)元存活率為56.9％，與SNP組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，n=9)；單純給予TRPC阻斷劑或激動(dòng)劑對(duì)神經(jīng)元存活率沒有影響(P>0.05)。 ②各組細(xì)胞處理后，Hoechst33342染色，熒光顯微鏡下觀察，空白對(duì)照組神經(jīng)元胞核均勻藍(lán)染；SNP處理組神經(jīng)元胞核明顯固縮、凝聚，可見高亮藍(lán)染的凋亡小

6、體；SNP+TRPC激動(dòng)劑組凋亡細(xì)胞明顯增多；而SNP+TRPC阻斷劑組神經(jīng)元胞核均勻藍(lán)染，細(xì)胞無凋亡小體等凋亡特有的形態(tài)學(xué)變化。 3.給予SNP處理24小時(shí)后，通過real-timeRT-PCR檢測TRPC1的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)SNP處理并不影響TRPC1mRNA在水平上的表達(dá)(P>0.05，n=6)。 4.通過real-timeRT-PCR檢測p53下游基因的表達(dá)變化，確認(rèn)SNP誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡的p53下游信號(hào)分子。

7、結(jié)果顯示SNP處理神經(jīng)元4h、8h、24h后，p53下游靶基因Bax，Apaf-1和survivin表達(dá)無明顯變化P>0.05)。而PUMA則在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別增加至1.95，1.82和1.96倍，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，n=6)。 5.TRPC通道阻斷劑2-APB，顯著降低SNP誘導(dǎo)的PUMA上調(diào)(1.95vs1.13)(P<0.01，n=6)。 結(jié)論: TRPC1-6亞型在原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元上