GSK3β在多巴胺能神經(jīng)元凋亡中作用的研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson Disease,PD)是世界第二大神經(jīng)變性疾病。自從1963年Greer等證實了黑質(zhì)中多巴胺神經(jīng)元變性缺失是PD的主要病理特征以來,科學(xué)家一直在探討引起黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元缺失的因為。研究多巴胺能神經(jīng)元死亡的分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,對揭示PD發(fā)生、發(fā)展的本質(zhì),尋找其藥物治療靶點,具有重要的研究意義。
　　 6-羥基多巴(6-hydroxydopamine,6-OHDA)是一種常用于建立PD離體與在體模型的神

2、經(jīng)毒物。有報道,在生理狀態(tài)下,人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多巴胺在代謝過程中也會產(chǎn)生中間產(chǎn)物6-OHDA。研究發(fā)現(xiàn),在PD患者中腦黑質(zhì)內(nèi),6-OHDA水平偏高,可損傷中腦黑質(zhì)致密部的多巴胺能神經(jīng)元,引起神經(jīng)元內(nèi)多巴胺代謝的異常,多巴胺能神經(jīng)元特征性指標(biāo)酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)表達(dá)的下降,最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的死亡。因此,應(yīng)用6-OHDA建立模型可很好地研究多巴胺能神經(jīng)元損傷的分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,了解PD發(fā)病的

3、過程。
　　 凋亡是細(xì)胞死亡的一種重要形式,大量離體、在體研究表明,凋亡是一種與PD密切相關(guān)的重要分子機(jī)制。有研究小組報道,在PD患者黑質(zhì)致密部中可觀察到原位DNA碎片的出現(xiàn)；也有學(xué)者發(fā)現(xiàn),在黑質(zhì)致密部的多巴胺神經(jīng)元中觀察到核固縮、凋亡小體的出現(xiàn)。這些均提示,黑質(zhì)致密部的多巴胺神經(jīng)元很有可能發(fā)生了凋亡。眾多應(yīng)用6-OHDA研究PD的實驗表明,6-OHDA可引起多巴胺能神經(jīng)元的凋亡。研究發(fā)現(xiàn),向大鼠單側(cè)黑質(zhì)注射6-OHDA后,可在

4、黑質(zhì)區(qū)域觀察到DNA斷裂、細(xì)胞固縮等凋亡特異性的形態(tài)學(xué)改變；在離體實驗中,6-OFIDA能激活大鼠中腦原代多巴胺神經(jīng)元的caspase-3、PARP(poly ADP-ribose polymerase),引起細(xì)胞凋亡。然而,6-OHDA引起多巴胺能神經(jīng)元凋亡的機(jī)制并未完全清楚。有證據(jù)顯示,6-OHDA是通過激活MN9D多巴胺能神經(jīng)元中的caspase-9,進(jìn)而啟動內(nèi)源性細(xì)胞凋亡信號通路,最終引起凋亡；但另一個研究小組則發(fā)現(xiàn),6-OHD

5、A可激活MN9D細(xì)胞中caspase-9和caspase-8,同時啟動內(nèi)源性細(xì)胞凋亡信號通路和外源性細(xì)胞凋亡信號通路；但是,有研究小組向大鼠單側(cè)紋狀體立體定位注射6-OHDA建立PD動物模型,并探討多巴胺能神經(jīng)元受損的機(jī)制,他們并未發(fā)現(xiàn)6-OHDA可激活caspase-9和caspase-3。因此,6-OHDA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡其中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍有待研究明確。
　　 近年,有不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)GSK3β在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要的作用。在PI

6、3K/AKT/GSK3β信號通路當(dāng)中,PI3K(磷脂酰肌醇-3-激酶,phosphatidylinositol-3-kinase)磷酸化AKT(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)上Ser473位點,激活了AKT,后者磷酸化GSK3β,調(diào)節(jié)其活性,從而實現(xiàn)對其下游底物的調(diào)控。常見的GSK3β磷酸化位點主要有兩個:一個是Ser9位點,另一個是Thr216位點。Ser9位點被磷酸化后可降低GSK3β的活性,而激活域中的Tyr216位點被磷酸化后則可提高

7、GSK3β的活性,凋亡前信號主要是通過這兩種方式調(diào)節(jié)GSK3β的活性,最終控制細(xì)胞凋亡的。一項關(guān)于放射損傷的研究發(fā)現(xiàn),通過下調(diào)caspase-3等凋亡蛋白的表達(dá),GSK3β的抑制劑可緩解C57BL/6J小鼠小腸受到的放射性損傷；有報道,組成性激活的GSK3β突變體可激活Bax,加劇代謝應(yīng)激對腎上皮細(xì)胞的損傷。眾多數(shù)據(jù)顯示,GSK3β參與了多種組織的細(xì)胞凋亡過程。然而,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,有關(guān)GSK3β在多巴胺能神經(jīng)元凋亡過程中所起作用方面

8、的研究仍處于初級階段。
　　 有研究小組觀察了PD患者腦組織切片,發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)中路易小體中除了表達(dá)α-共核蛋白外,還表達(dá)GSK3β及其磷酸化蛋白p-GSK3β(Ser9)；PD患者存在GSK3β的單核苷酸多態(tài)性；Chen等發(fā)現(xiàn),GSK3β的抑制劑可緩解SH-SY5Y細(xì)胞中由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。然而,我們不能否認(rèn),作為外源性蛋白的抑制劑是有一定局限性的。因此,本課題的研究目的在于以下幾點:
　　 1.初步探討6-OHDA

9、是通過內(nèi)源性凋亡通路還是外源性凋亡通路啟動SH-SY5Y的凋亡:
　　 2.明確6-OHDA是否通過激活GSK3β,最終啟動SH-SY5Y多巴胺能神經(jīng)元的凋亡;
　　 3.通過shRNA干擾,沉默內(nèi)源性GSK3β的表達(dá),觀察其對SH—SY5Y凋亡的影響,進(jìn)一步闡明GSK3β在6-OHDA誘導(dǎo)SH—SY5Y凋亡中的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.6-OHDA損傷的SH-SY5Y帕金森病離體細(xì)胞模型中凋亡相關(guān)

10、蛋白表達(dá)水平升高
　　 用6-OHDA(100uM)培養(yǎng)基處理SH-SY5Y細(xì)胞0、2、4、6、8、12、24小時,收集蛋白后用PARP和caspase-3的特異抗體檢測這兩種凋亡相關(guān)蛋白活化狀態(tài)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,6-OHDA(100uM)處理SH—SY5Y細(xì)胞6小時后,活化的PARP與活化的caspase-3蛋白水平均明顯升高,隨著時間的延長表達(dá)水平持續(xù)升高,說明6-OHDA激活了SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的凋亡過程。為了進(jìn)一步

11、了解6-OHDA激活SH—SY5Y細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,我們用caspase-8和caspase-9的特異抗體檢測這兩種凋亡相關(guān)蛋白活化狀態(tài)的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)6-OHDA(100uM)處理SH-SY5Y細(xì)胞6小時后,活化的caspase-9蛋白的表達(dá)水平顯著升高,且隨著時間的延長表達(dá)水平持續(xù)升高,而活化的caspase-8蛋白表達(dá)水平未見明顯變化。說明在SH—SY5Y細(xì)胞中,6-OHDA是通過激活內(nèi)源性細(xì)胞凋亡信號通路,而不是通過激活外

12、源性細(xì)胞凋亡信號通路引起細(xì)胞損傷的。
　　 2.6-OHDA激活了SH-SYSY細(xì)胞中的GSK3β
　　 用6—OHDA(100uM)培養(yǎng)基處理SH—SY5Y細(xì)胞0、2、4、6、8、12、24小時,收集蛋白后用PI3K和AKT的特異性抗體檢測PI3K/AKT/GSK3β通路中這兩個上游激酶的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),6—OHDA(100uM)處理SH—SYSY細(xì)胞6小時后,PI3K和AKT的蛋白表達(dá)水平均明顯下降,并且隨著時間

13、的延長,這兩種蛋白的表達(dá)水平進(jìn)一步下降。這說明了6—OHDA可下調(diào)PI3K和AKT的表達(dá),從而使AKT的激酶活性明顯下降。在此基礎(chǔ)之上,我們分別用GSK3β和兩個磷酸化特異的GSK3β抗體,p—GSK3β(Ser9)和p-GSK3β(Tyr216),檢測GSK3β是否被激活了。結(jié)果發(fā)現(xiàn),6-OHDM100uM)處理SH-SY5Y細(xì)胞后,GSK3β的蛋白表達(dá)水平稍有下降；同時,6-OHDA(100uM)的處理下調(diào)了p—GSK3β(Ser9

14、)的表達(dá)水平,并且上調(diào)了p-GSK3β(Tyr216)的表達(dá)水平,隨著時間的延長,這兩個磷酸化蛋白表達(dá)水平變化更明顯了。這說明,6-OHDA激活了GKS3β。
　　 3.小分子RNA干擾GSK3β可緩解SH-SY5Y中由6-OHDA引起的細(xì)胞凋亡
　　 我們已經(jīng)證明了6-OHDA可啟動SH-SY5Y細(xì)胞的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,引起細(xì)胞凋亡,我們也證明了6-OHDA可激活GKS3β,那么此二者是伴隨關(guān)系還是先后關(guān)系呢

15、?雖然Chen等的研究發(fā)現(xiàn)GSK3β的特異性抑制劑可緩解6-OHDA在SH-SY5Y中誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,但內(nèi)源性GSK3β在其中的作用仍未清楚。為了探求此點,我們使用小分子RNA干擾的技術(shù)特異性地沉默了SH—SY5Y細(xì)胞中GSK3β的表達(dá),以了解內(nèi)源性GSK3β對6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響。我們購買四個商品化的候選小分子RNA干擾表達(dá)質(zhì)粒psiU6-shRNA-GSK3β-1、psiU6-shRNA—GSK3β-2、ps

16、iU6-shRNA-GSK3β—3、psiU6-shRNA-GSK3β-4,通過挑取單克隆細(xì)胞,并進(jìn)行針對GSK3β的real-timePCR和Western Blotting,從RNA水平和蛋白質(zhì)水平進(jìn)行檢測,我們成功篩選出對GSK3β干擾效率達(dá)70％以上的單克隆細(xì)胞psiU6-shRNA-GSK3β-SH-SY5Y。
　　 然后,我們以6-OHDA(100uM)培養(yǎng)基分別處理SH-SY5Y細(xì)胞、含有空載體psiU6的psiU

17、6-shRNA-control—SH-SY5Y單克隆細(xì)胞和psiU6-shRNA-GSK3β-SH—SY5Y單克隆細(xì)胞0、2、4、6、8、12、24小時后,檢測細(xì)胞活力的變化。我們發(fā)現(xiàn),6-OHDA(100uM)處理6小時后,均可引起三種單克隆細(xì)胞的細(xì)胞活力下降,但在psiU6-shRNA-GSK3β-SH-SY5Y單克隆細(xì)胞中細(xì)胞活力下降程度明顯少于SH—SY5Y細(xì)胞和psiU6-shRNA-control-SH—SY5Y單克隆細(xì)胞的

18、下降程度,并且這種差別隨著6-OHDA處理時間的延長持續(xù)存在。這說明了,GSK3β的小RNA干擾可緩解6-OHDA對SH—SY5Y的損傷。
　　 既然沉默內(nèi)源性GSK3β表達(dá)可緩解6-OHDA對SH-SY5Y的損傷,那么這種損傷的緩解是否是由于下調(diào)了細(xì)胞內(nèi)的凋亡而實現(xiàn)的呢?為此,我們以6-OHDA(100uM)培養(yǎng)基分別處理psiU6-shRNA-control-SH—SY5Y單克隆細(xì)胞和psiU6-shRNA-GSK3β-SH

19、—SY5Y單克隆細(xì)胞0、4、8、24小時后,檢測這兩種單克隆細(xì)胞caspase-3、caspase-8和caspase-9活化狀態(tài)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,6-OHDA(100uM)處理4小時后,psiU6-shRNA-control—SH-SY5Y單克隆細(xì)胞和psiU6-shRNA-GSK3β-SH-SY5Y單克隆細(xì)胞中活化caspase-3和活化caspase-9的表達(dá)水平均明顯升高,但psiU6-shRNA-GSK3β-SH—SY

20、5Y單克隆細(xì)胞中此兩種蛋白表達(dá)水平升高程度則明顯小于前者,隨著6-OHDA處理時間的延長,這種差別持續(xù)存在。這說明了,小分子RNA干擾GSK3β可緩解SH—SY5Y中由6-OHDA引起的細(xì)胞凋亡。
　　 到目前為止,有關(guān)GSK3β在PD多巴胺能神經(jīng)元死亡作用的研究多采用GSK3β的特異抑制劑開展,本課題首次采用特異靶向GSK3β的shRNA干擾技術(shù),研究GSK3β在6-OHDA誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元凋亡過程中的作用。此外,本課題也證

21、明了,在PD離體細(xì)胞模型SH-SYSY中,6-OHDA是通過內(nèi)源性凋亡通路來激活凋亡的。但由于時間有限,我們未應(yīng)用GSK3β的組成性激活突變體(constitutivelyactive mutant)和顯性負(fù)性突變體(dominant negative mutant)來展開進(jìn)一步的研究。
　　 結(jié)論：
　　 1.6-OHDA通過啟動SH-SY5Y細(xì)胞中內(nèi)源性細(xì)胞凋亡而引起細(xì)胞損傷；
　　 2.沉默內(nèi)源性GSK3β