外源多巴胺對(duì)α-Synuclein過(guò)表達(dá)多巴胺能神經(jīng)元的影響.pdf

1、目的:探討外源多巴胺對(duì)α-Synuclein過(guò)表達(dá)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞功能的影響，為闡明“左旋多巴/多巴胺治療是否會(huì)加速帕金森病病情進(jìn)展”提供體外實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:（1）構(gòu)建帕金森病體外細(xì)胞模型：利用脂質(zhì)體將野生型α-Synuclein-pcDNA3．1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染多巴胺能細(xì)胞系SK-N-SH，通過(guò)G418篩選獲得穩(wěn)定克隆，并通過(guò)RT-PCR和Western blot鑒定目的基因α-Synuclein在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平。（2

2、）觀察過(guò)表達(dá)α-Synuclein對(duì)SK-N-SH細(xì)胞功能的影響：分別以α-Synuclein-pcDNA3．1重組質(zhì)粒和pcDNA3．1空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，通過(guò)MTT法、比色法、流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR和Western blot分別比較兩組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和生長(zhǎng)活性、MDA含量、早期凋亡率、凋亡相關(guān)基因Caspase-3、P53、Bcl-2、Bax和氧化應(yīng)激相關(guān)基因SOD1、SOD2、CAT的轉(zhuǎn)錄水平及Caspase-3

3、、P53、Bcl-2、Bax的表達(dá)水平。（3）觀察添加外源多巴胺對(duì)α-Synuclein過(guò)表達(dá)SK-N-SH細(xì)胞功能的影響：以不添加DA的細(xì)胞株為對(duì)照組，按添加多巴胺的終濃度值將實(shí)驗(yàn)組分為50 uM DA組、100 uM DA組、300 uM DA組和500 uM DA組。通過(guò)MTT法、比色法、流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR和Western blot分別比較各組細(xì)胞活性、MDA含量、早期凋亡率、凋亡相關(guān)基因Caspase-3、P53、Bcl-

4、2、Bax和氧化應(yīng)激相關(guān)基因SOD1、SOD2、CAT的轉(zhuǎn)錄水平及Caspase-3、P53、Bcl-2、Bax的表達(dá)水平。 結(jié)果:（1）帕金森病細(xì)胞模型的構(gòu)建：α-Synuclein-pcDNA3．1重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染SK-N-SH細(xì)胞系，通過(guò)350 ug/ml的G418篩選獲得陽(yáng)性克隆，RT-PCR和Western blot結(jié)果表明目的基因α-Synuclein在α-Synuclein-pcDNA3．1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)錄和表

5、達(dá)水平均高于pcDNA3．1空載體轉(zhuǎn)染組，證實(shí)穩(wěn)定表達(dá)野生型α-Synuclein的細(xì)胞模型構(gòu)建成功。（2）過(guò)表達(dá)α-Synuclein對(duì)SK-N-SH細(xì)胞功能的影響：MTT法顯示實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、活性下降；比色法測(cè)定吸光度顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞勻漿MDA含量高于對(duì)照組；流式細(xì)胞術(shù)顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞早期凋亡率高于對(duì)照組；RT-PCR顯示基因Caspase-3、P53、Bax、SOD1、SOD2和CAT在實(shí)驗(yàn)組的轉(zhuǎn)錄水平高于對(duì)照組、基因Bc

6、l-2在實(shí)驗(yàn)組的轉(zhuǎn)錄水平低于對(duì)照組；Western blot顯示Caspase-3、P53和Bax在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)水平高于對(duì)照組、Bcl-2在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)水平低于對(duì)照組。（3）外源多巴胺對(duì)α-Synuclein過(guò)表達(dá)SK-N-SH細(xì)胞功能的影響：隨著外源多巴胺添加濃度的遞增，MTT法顯示細(xì)胞活性遞減；比色法顯示細(xì)胞勻漿MDA含量遞增；流式細(xì)胞術(shù)顯示細(xì)胞早期凋亡率遞增；RT-PCR顯示基因Caspase-3、P53、Bax、SOD1、SOD

7、2和CAT的轉(zhuǎn)錄水平遞增、基因Bcl-2的轉(zhuǎn)錄水平遞減；Western blot顯示Caspase-3、P53和Bax的表達(dá)水平遞增、Bcl-2的表達(dá)水平遞減。 結(jié)論:（1）過(guò)表達(dá)野生型α-Synuclein增強(qiáng)SK-N-SH細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，加速細(xì)胞凋亡。（2）添加外源多巴胺增強(qiáng)α-Synuclein過(guò)表達(dá)SK-N-SH細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，加速細(xì)胞凋亡，且這種效應(yīng)呈劑量依賴性。（3）體外實(shí)驗(yàn)提示應(yīng)用左旋多巴/多巴胺治療帕金森