血管緊張素Ⅱ對多巴胺能神經元凋亡的影響及機制研究.pdf

1、隨著全球人口老齡化進程的加劇，帕金森病(Parkinson's disease，PD)深深影響著全球范圍內老年人的生活質量，同時也造成了巨大的社會經濟負擔。PD最主要的臨床表現是運動遲緩、靜止性震顫、肌強直和姿勢平衡障礙，主要的病理學特點是黑質區(qū)多巴胺能神經元的進行性缺失。目前其發(fā)病機制尚不明確，且缺乏有效的防治手段阻止疾病的進程。近來越來越多的研究發(fā)現，PD患者及PD動物模型的腦中，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotens

2、in-system，RAS)的主要組成部分血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)的含量明顯增高，提示PD的發(fā)病機制與腦內RAS的過度激活密切相關。因此，從生物學層面研究AngⅡ與PD病理進程的關聯，成為了本領域的一個研究熱點。
　　RAS主要負責調節(jié)機體的血壓和水、鹽平衡，維持內環(huán)境的穩(wěn)定。腦中及體內多個組織和器官均存在獨立的RAS系統(tǒng)，稱為局部RAS系統(tǒng)。且與循環(huán)系統(tǒng)RAS的主要成分相似，局部RAS也可見AngⅡ及其

3、1型受體(AT1R)和2型受體(AT2R)的穩(wěn)定表達。包括我課題組在內的不少先前實驗已經發(fā)現，AngⅡ與帕金森病多巴胺能神經元的損傷緊密相關，且利用血管緊張素轉換酶抑制劑(ACE inhibitors，ACEI)或AngⅡ受體拮抗劑(AngiotensinⅡ receptor blockers，ARB)阻斷AngⅡ介導的信號通路可減少基底節(jié)區(qū)多巴胺能神經元的凋亡。此外，在諸如心臟、腎臟等組織或器官中，AngⅡ均可通過增強自噬活動以加劇心

4、肌細胞和腎臟足細胞的凋亡，從而加強對心肌和腎臟的損傷，這提示細胞凋亡可能與自噬密不可分。因此，在本研究的第一部分，我們擬利用可以穩(wěn)定表達AT1R和AT2R的Cath.a多巴胺能細胞株作為研究對象，分別觀察AngⅡ對神經元凋亡和自噬的影響以及神經元凋亡和自噬之間的關聯，并進一步觀察何種受體參與了AngⅡ引起前述效應的過程，從而闡明AngⅡ對離體多巴胺能神經元的影響及相關機制。
　　ARB類藥物已被部分實驗證明對多巴胺能神經元具有保護

5、作用，而目前關于ARB類藥物對PD動物模型病理學及行為學的影響及分子機制的研究較少。因此，在本研究的第二部分，我們首先利用魚藤酮構建PD大鼠模型，觀察黑質區(qū)AngⅡ和AT1R、AT2R含量的表達變化，以從活體層面初步探尋AngⅡ及其何種受體可能參與PD的病理進程。接著，通過外源性AngⅡ和（或）一種AngⅡ受體拮抗劑氯沙坦連續(xù)一周對大鼠注射給藥，觀察AngⅡ及氯沙坦對正常大鼠黑質區(qū)多巴胺能神經元凋亡的影響。最后，通過對魚藤酮造模成功的P

6、D大鼠進行阿齊沙坦（一種新型AT1受體拮抗劑）灌胃，觀察阿齊沙坦對PD動物模型多巴胺能神經元及其PD癥狀的影響，以明確AT1受體拮抗劑在PD治療中的保護作用。
　　綜上所述，本項目的完成不僅能從離體和活體層面探究AngⅡ對多巴胺能神經元凋亡的影響，更能揭示PD的部分發(fā)病機制，從而為PD的預防與治療提供新的靶點和理論依據。
　　第一部分血管緊張素Ⅱ對多巴胺能神經元細胞株凋亡和自噬的影響及機制研究
　　目的:研究AngⅡ對

7、Cath.a多巴胺能神經元細胞株凋亡和自噬的影響及相關機制。
　　方法:本實驗利用一種可以穩(wěn)定表達AT1R和AT2R的多巴胺能細胞株——Cath.a細胞作為研究對象，(1)研究AngⅡ對細胞凋亡的影響:低、中、高不同濃度的AngⅡ分別處理細胞后，采用蛋白免疫印跡法觀察各組凋亡標志物cleavedcaspase-3的蛋白表達，采用caspase3活性檢測試劑盒檢測各組細胞caspase3的活性，采用流式細胞儀測量各組細胞的凋亡率;(

8、2)研究AngⅡ對細胞自噬的影響:低、中、高不同濃度的AngⅡ處理細胞后，采用蛋白免疫印跡法觀察各組自噬標志物LC3-Ⅱ和p62的蛋白含量，采用免疫熒光法比較各組細胞LC3-Ⅱ的表達;(3)研究細胞凋亡和自噬間的關聯:利用自噬抑制劑3-MA阻斷AngⅡ對細胞自噬的激活，觀察自噬被抑制后，AngⅡ對細胞凋亡標志物cleaved caspase-3及caspase3活性的變化;(4)研究何種受體參與了AngⅡ的前述作用:利用AT1受體拮抗劑

9、氯沙坦和AT2受體拮抗劑PD123319分別干預AngⅡ介導的信號通路，觀察AT1R和AT2R被阻斷后，AngⅡ對細胞凋亡標志物cleaved caspase-3、caspase3活性以及自噬標志物LC3-Ⅱ和p62的變化。
　　結果:與對照組相比，中、高濃度AngⅡ可以明顯增加Cath.a細胞cleavedcaspase-3的蛋白表達、caspase3活性及細胞凋亡率;與對照組相比，中、高濃度AngⅡ可以顯著增加Cath.a細胞

10、LC3-Ⅱ的蛋白含量、降低p62的蛋白含量、增強LC3-Ⅱ在細胞的表達;自噬抑制劑3-MA可以完全阻斷AngⅡ對細胞自噬的激活，與此同時，AngⅡ對細胞的凋亡作用也被完全抑制;AT1受體拮抗劑氯沙坦給藥后，AngⅡ對細胞的自噬和凋亡作用被完全逆轉，而AT2受體拮抗劑PD123319對此并無顯著影響。
　　結論:(1) AngⅡ可以增加多巴胺能神經元的凋亡和自噬活動;(2) AngⅡ對細胞凋亡的增強作用可通過激活自噬實現;(3)AT

11、1受體而非AT2受體參與AngⅡ對細胞的上述作用。
　　第二部分血管緊張素Ⅱ對帕金森病大鼠病理學及行為學的影響及機制研究
　　目的:研究AngⅡ對PD大鼠模型黑質區(qū)多巴胺能神經元的凋亡和對其PD癥狀的影響及相關機制。
　　方法:本實驗利用Lewis大鼠作為研究對象，(1)研究PD病理進程是否與RAS的過度激活有關:在魚藤酮成功構建PD大鼠模型后，采用ELISA試劑盒、實時定量PCR法和蛋白免疫印跡技術檢測大鼠黑質區(qū)An

12、gⅡ及其AT1R、AT2R的含量變化;(2)研究外源性AngⅡ對正常大鼠黑質區(qū)多巴胺能神經元凋亡的影響及所依賴的受體:對大鼠右側黑質區(qū)持續(xù)一周直接注射外源性AngⅡ和（或）AT1R拮抗劑氯沙坦，采用免疫組化技術觀察各組大鼠黑質區(qū)TH陽性細胞數，采用caspase-3活性試劑盒比較各組大鼠黑質區(qū)神經元的caspase-3活性;(3)研究新型AT1R拮抗劑阿齊沙坦對PD大鼠黑質區(qū)多巴胺能神經元凋亡和對其PD癥狀的影響:對魚藤酮造模成功的PD

13、大鼠進行阿齊沙坦灌胃，采用免疫組化技術和caspase-3活性試劑盒觀察不同組大鼠黑質區(qū)神經元的凋亡情況，采用垂直網格實驗及水平杠桿實驗對各組大鼠行為學進行檢測。
　　結果:與對照組相比，PD大鼠組黑質區(qū)AngⅡ及AT1R含量明顯升高，而AT2R含量無明顯變化;外源性AngⅡ注射組相較對照組顯著減少大鼠右側黑質區(qū)TH陽性細胞的表達及增高其caspase-3活性，而AngⅡ的上述作用在氯沙坦共同給藥后被完全阻斷;相較PD組，阿齊沙坦