Ghrelin對(duì)MPTP小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用及可能機(jī)制研究.pdf

1、帕金森病(parkinson’s disease，PD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以肌強(qiáng)直、肢體震顫和運(yùn)動(dòng)減少等癥狀為主要臨床表現(xiàn)。PD病理特征主要是中腦黑質(zhì)致密帶(substantia nigra pars compact，SNpc)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元死亡。PD的病因未完全明了，可能有多種因素參與，如遺傳、環(huán)境因素、氧化應(yīng)激、興奮生毒素、自身免疫、黑質(zhì)(substantia nigra，SN)、鐵聚積和

2、細(xì)胞凋亡等。近年來對(duì)PD中DA能神經(jīng)元死亡機(jī)制的大量研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡在PD發(fā)病中起著重要的作用，應(yīng)用電鏡技術(shù)可在DA能細(xì)胞中觀察到染色質(zhì)濃縮和凋亡小體等特征，能夠抑制細(xì)胞凋亡的物質(zhì)可以保護(hù)DAN能神經(jīng)元。 Ghrelin是Kojima等1999年發(fā)現(xiàn)的一種腦．腸肽，由28個(gè)氨基酸殘基組成，為生長(zhǎng)激素促分泌素受體(growth hormone secretagogue receptor,GHS-R)的內(nèi)源性配體，有刺激食欲，促進(jìn)

3、攝食，減少能量消耗和增加體重等作用。最近的研究表明Ghrelin能夠刺激脂肪前體細(xì)胞、成骨細(xì)胞多種細(xì)胞的增殖并具有抑制凋亡的作用，GHS-R1a特異性拮抗劑D-Lys<'3>-GHRP-6能阻斷其抑制脂肪前體細(xì)胞和體外培養(yǎng)的下丘腦神經(jīng)元凋亡的作用。由于Ghrelin的功能性受體GHS-R 1a mRNA在SN DA能神經(jīng)元有較高表達(dá)，為研究Ghrelin是否能夠保護(hù)SN DA能神經(jīng)元并探索其作用的可能機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)選擇了MPTP制備小鼠P

4、D模型，應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)在蛋白水平上觀察SNpc GHS-R 1a與酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxlase，TH)共存的情況，利用高效液相色譜電化學(xué)檢測(cè)法(high performance liquid chromatography-electrochemicaldetection，HPLC-ECD)和免疫組織化學(xué)的方法觀察Ghrelin對(duì)紋狀體(striatum，Str)DA及其代謝產(chǎn)物二羥基苯乙酸(dihydrox

5、yphenylace-tic acid，DOPAC)和高香草酸(homovanillic acid，HVA)的含量經(jīng)及SNpc DA能神經(jīng)元存活情況的影響；為了進(jìn)一步研究Ghrelin的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，我們采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(semi-quantitive reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Ghrelin對(duì)SN TH、caspas

6、e-3、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響；同時(shí)，我們應(yīng)用GHS-R1a的特異性拮抗劑-D-nys<'3>-GHRP-6觀察其對(duì)Ghrelin神經(jīng)保護(hù)作用的影響。結(jié)果如下： 1．TH與GHS-R 1a在C57BL/6小鼠的SNpc共存。 2.MPTP造成小鼠Str DA、DOPAC和HVA含量的減少以及DA代謝率的升高(P<0.05)，較高劑量的Ghrelin(200ng，400ng)對(duì)于防止DA及其代謝產(chǎn)物的減少和抑制DA代

7、謝率升高有明顯的作用，可以有效減輕MPTP的毒性損傷作用。單獨(dú)側(cè)腦室注射Ghrelin對(duì)于小鼠Str DA及其代謝產(chǎn)物的含量及DA代謝率沒有明顯改變(P>0.05)。應(yīng)用GHS-R 1a的拮抗劑，D-LVs3-GHRP-6，可以阻斷Ghrelin的上述作用。 3.MPTP導(dǎo)致小鼠SN TH mRNA表達(dá)量降低(P<0.05)，TH免疫陽性細(xì)胞數(shù)目減少(P<0.05)。100ng、200 ng和400 ng Ghrelin可結(jié)抗M

8、PTP造成的DA能神經(jīng)元缺失及TH mRNA表達(dá)降低。Ghrelin組的TH免疫陽性細(xì)胞數(shù)及其mRNA表達(dá)量與Control組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P>0.05)。Ghrelin受體GHS-R 1a的拮抗劑D-Lys<'3>-GHRP-6可以完全阻斷Ghrelin對(duì)DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用。 4.MPTP組小鼠SNpc的caspase-3免疫陽性細(xì)胞與Control組相比顯著增加(P<0.05)，且組織著色加深。Ghrelin對(duì)MPTP造

9、成caspase-3活性增加的抑制具有劑量依賴性，50 ng與100 ng不能減少caspase-3免疫陽性細(xì)胞的數(shù)量，200 ng和400 ng與50 ng與100 ng相比，具有明顯的抑制作用(P<0.05)。Ghrelin組SNpc的caspase.3免疫陽性細(xì)胞數(shù)目和Control組相比無明顯差別(P>0.05)。拮抗劑D-Lys<'3>-GHRP-6可以阻斷Ghrelin下調(diào)caspase-3免疫陽性神經(jīng)元的作用。 5

10、.MPTP PD模型小鼠與正常小鼠相比，SN Bcl-2 mRNA表達(dá)量及免疫陽性細(xì)胞數(shù)目減少(P<0.05)。100 ng、200 ng和400 ng Ghrelin可以隨劑量增加逐步逆轉(zhuǎn)MPTP造成的Bcl-2 mRNA表達(dá)量和免疫陽性細(xì)胞減少的狀況。Ghrelin對(duì)正常小鼠SN Bcl-2 mRNA和蛋白水平并無影響(P>0.05)。GHS-R 1a的拮抗劑D-Lys<'3>-GHRP-6可以阻斷Ghrelin對(duì)Bcl-2的上調(diào)作

11、用。 6.MPTP組小鼠SN Bax mRNA表達(dá)量顯著高于正常小鼠(P<0.05)，Ghrelin各個(gè)劑量組(50 ng、100 ng、200 ng和400 ng)對(duì)由MPTP造成的Bax mRNA的表達(dá)量增加都有抑制作用(P<0.05)，該抑制作用隨Ghrelin劑量的增加而增強(qiáng)。Ghrelin對(duì)Bax表達(dá)的抑制可以完全被GHS-R 1a拮抗劑D-Lys<'3>-GHRP-6阻斷。Ghrelin組和Control組的表達(dá)量沒

12、有差別。 7.Ghrelin可以使正常小鼠SN Bcl-2/Bax的比值變大(P<0.05)，MPTP導(dǎo)致小鼠SN Bcl-2/Bax顯著低于正常小鼠(P<0.05)。50 ng Ghrelin即可緩解MPTP降低Bcl-2/Bax的狀況(P<0.05)，200 ng和400 ng Ghrelin可逆轉(zhuǎn)Bcl-2/Bax比值的降低(P<0.05)。D-Lys<'3>-GHRP-6組Bcl-2/Bax與MPTP組相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

13、義。上述結(jié)果說明，MPTP可引起SN TH蛋白和mRNA表達(dá)水平降低，Str DA及其代謝產(chǎn)物含量減少，DA代謝率升高；給予Ghrelin之后，可以明顯減輕MPTP的神經(jīng)毒性作用，增加SN TH mRNA的表達(dá)，減輕DA能神經(jīng)元缺失的狀況，升高Str DA及其代謝產(chǎn)物含量；該保護(hù)作用是通過增加Bcl-2 mRNA的表達(dá)和蛋白含量，抑制Bax mRNA的表達(dá)以及caspase-3的活性而實(shí)現(xiàn)的；Ghrelin的細(xì)胞保護(hù)作用由GHS-R 1