中腦腹側(cè)被蓋區(qū)多巴胺能神經(jīng)元參與抑郁發(fā)生的機(jī)制研究.pdf

1、抑郁癥（Depression）是一種慢性長期的精神類疾病，全球范圍內(nèi)約1.2億人口深受其害。雖然目前關(guān)于抑郁癥發(fā)生的病因和神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制的研究已經(jīng)取得了突破性進(jìn)展，但是關(guān)于抑郁癥發(fā)生的電生理和分子機(jī)制仍需要待進(jìn)一步闡明。
　　VTA多巴胺能神經(jīng)元在獎(jiǎng)勵(lì)、動(dòng)機(jī)、藥物成癮等動(dòng)物行為中起重要作用。最近有文章報(bào)道，實(shí)驗(yàn)證明中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（Ventral tegmental area，VTA）多巴胺能神經(jīng)元可能參與了抑郁癥的發(fā)生。特異性激活

2、或者抑制中腦腹側(cè)被蓋區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的自發(fā)放電能明顯影響抑郁動(dòng)物的行為學(xué)表現(xiàn)，但其具體的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的探究。慢性疼痛、慢性應(yīng)激和抑郁癥的發(fā)生存在重要的聯(lián)系，臨床上許多慢性疼痛和長期遭受應(yīng)激的患者常伴隨抑郁癥狀，但其機(jī)制確不清楚。研究目的：本研究擬模擬臨床上慢性疼痛和長期遭受應(yīng)激的患者，建立慢性神經(jīng)痛和慢性溫和不可預(yù)知性刺激（CUMS）兩種抑郁大鼠模型；在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用在體多通道神經(jīng)電生理記錄系統(tǒng)（ Multichannel Ac

3、quisition Processor(MAP) Neurophysiology System）記錄抑郁發(fā)生后的VTA多巴胺能神經(jīng)元自發(fā)電活動(dòng)；并在藥物治療恢復(fù)后，記錄分析VTA多巴胺能神經(jīng)元的電活動(dòng)的變化情況；并應(yīng)用免疫組化的方法，分析在此病理過程中超極化激活的環(huán)核苷酸門控的離子通道（HCN）通道表達(dá)改變的情況，從而初步探討VTA多巴胺能神經(jīng)元參與抑郁癥發(fā)生的電生理分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.抑郁大鼠模型的建立：

4、>　?。?）慢性神經(jīng)痛誘發(fā)抑郁癥：我們采用坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷模型(spared nerve injury,SNI)，采用機(jī)械性刺激縮足閾值、糖水偏好、強(qiáng)迫游泳以及曠場實(shí)驗(yàn)作為行為學(xué)評(píng)定指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)開始前，48只SPF成年健康大鼠在隔離屏障環(huán)境適應(yīng)一周后，進(jìn)行隨機(jī)分組，分為假手術(shù)組大鼠12只和SNI組大鼠36只，并測得機(jī)械痛閾值基值。只暴露假手術(shù)組大鼠神經(jīng)而不進(jìn)行結(jié)扎，結(jié)扎并剪斷SNI組大鼠的腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)，并且需要完整保留，不能牽拉

5、腓腸神經(jīng)。在SNI手術(shù)后的第3、14、28、56天，進(jìn)行機(jī)械性刺激縮足閾值測得，第14、28、56天進(jìn)行礦場實(shí)驗(yàn)、糖水偏好、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抑郁行為學(xué)評(píng)定。將SNI組大鼠隨機(jī)分為兩組，分別腹腔注射一種臨床上廣泛使用的神經(jīng)病理性疼痛鎮(zhèn)痛藥加巴噴丁（100mg/kg）和生理鹽水14天，進(jìn)行行為學(xué)觀察。
　?。?）建立另一種大鼠抑郁癥模型：即采用慢性不可預(yù)知輕度應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress,C

6、UMS）刺激的方法對(duì)大鼠進(jìn)行長期應(yīng)激壓力刺激造模。采用百分比糖水偏好、曠場下活動(dòng)距離以及體重變化作為抑郁發(fā)生與否的行為學(xué)評(píng)定指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)前，大鼠在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障隔離環(huán)境飼養(yǎng)一周，使其適應(yīng)CUMS刺激環(huán)境。并按照隨機(jī)分組的原則將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組和CUMS組。然后進(jìn)行CUMS造模，在造模過程中，對(duì)照組大鼠3-4只合籠正常飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組大鼠單籠飼養(yǎng)并進(jìn)行CUMS造模6-8周，隨后根據(jù)行為學(xué)結(jié)果，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后得到具有抑郁行為大鼠。把經(jīng)CUM

7、S刺激后具有抑郁表型的大鼠進(jìn)行氟西汀治療恢復(fù)抑郁表型：其中一部分大鼠腹腔注射21天生理鹽水，另一部分大鼠連續(xù)腹腔注射21天的氟西汀，并給藥結(jié)束后，進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)，得到抑郁恢復(fù)的大鼠以及抑郁大鼠，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均需要進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)。
　　2.多通道電生理技術(shù)記錄分析：我們采用Plexon公司的多通道神經(jīng)電生理記錄分析系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行在體電生理記錄，并分析中腦腹側(cè)被蓋區(qū)VTA多巴胺能神經(jīng)元的自發(fā)放電特征。
　　在CUMS造模后篩

8、選抑郁癥狀大鼠，隨后進(jìn)行氟西汀注射進(jìn)行治療，記錄分析氟西汀治療后大鼠、抑郁癥大鼠、以及對(duì)照組大鼠的中腦腹側(cè)被蓋區(qū)多巴胺能神經(jīng)元自發(fā)電活動(dòng)，分析自發(fā)放電頻率與爆發(fā)式放電活動(dòng)。
　　在慢性神經(jīng)痛誘發(fā)抑郁癥實(shí)驗(yàn)中，通過篩選出慢性神經(jīng)痛誘導(dǎo)的抑郁癥狀的大鼠進(jìn)行加巴噴丁注射，記錄分析加巴噴丁治療組大鼠、神經(jīng)損傷組大鼠，以及假手術(shù)組大鼠的VTA多巴胺能神經(jīng)元自發(fā)放電特征。
　　3.大鼠中腦腹側(cè)被蓋區(qū)免疫熒光分析：在慢性神經(jīng)痛誘發(fā)抑郁癥大

9、鼠的VTA腦區(qū)，免疫熒光雙標(biāo)記酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase,TH）與超極化激活的環(huán)核苷酸離子通道（Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel,HCN）蛋白，觀察并統(tǒng)計(jì)分析HCN通道蛋白在中腦腹側(cè)被蓋區(qū)多巴胺能神經(jīng)元上的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.在慢性神經(jīng)痛誘發(fā)抑郁癥實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)比與假手術(shù)組大鼠，我們發(fā)現(xiàn)SNI大鼠的機(jī)械

10、刺激縮足閾值下降，表現(xiàn)為明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（n=6,P＜0.01）,糖水偏好（n=6，P＜0.01），曠場行走總路程（n=8,P＜0.01）均有所下降，強(qiáng)迫游泳靜止時(shí)間增加（n=10,P＜0.01）。在經(jīng)過14天加巴噴丁治療后，SNI組大鼠的抑郁行為得到緩解，相比較于SNI注射生理鹽水組的大鼠，加巴噴丁注射組大鼠的機(jī)械性刺激縮足反射閾值增加,（n=10,P＜0.001），在曠場下活動(dòng)的總路程增加（n=6,P＜0.001），具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)

11、意義。在強(qiáng)迫游泳中的靜止時(shí)間減少（n=8,P＜0.01），在糖水偏好方面增加（n=8,P＜0.01），表現(xiàn)為明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SNI組大鼠VTA多巴胺能神經(jīng)元自發(fā)放電頻率較假手術(shù)組大鼠增加,出現(xiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001），簇狀放電活動(dòng)顯著增加（P＜0.001）；經(jīng)過加巴噴丁治療后，加巴噴丁治療組大鼠VTA多巴胺能神經(jīng)元自發(fā)放電頻率較SNI組大鼠有所降低，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）,但簇狀放電活動(dòng)顯著增加，表現(xiàn)出明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差

12、異（P＜0.01）；但相比較于Sham組大鼠，加巴噴丁治療組大鼠的VTA多巴胺能神經(jīng)元自發(fā)放電頻率仍然增加（P＜0.01）,簇狀放電活動(dòng)出現(xiàn)高度統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001,n=132(SNI+Saline),n=81(SNI+GBP),n=71(Sham)）。同時(shí)HCN1蛋白在加巴噴丁治療組大鼠與鹽水注射組大鼠和Sham組大鼠的VTA腦區(qū)表達(dá)沒有差異（P＞0.05）;相比較于Sham組大鼠,HCN2在加巴噴丁治療組大鼠(P＜0.05)以

13、及鹽水組大鼠中均高調(diào)（P＜0.01），但是二者之間沒有差異（P＞0.05）,我們沒有發(fā)現(xiàn)HCN3在VTA的表達(dá)，同時(shí)沒有找到HCN4和TH在VTA共表達(dá)的細(xì)胞。
　　2.在CUMS抑郁癥模型實(shí)驗(yàn)中，在第一次8周CUMS造模后，與對(duì)照組大鼠相比較，CUMS造模組大鼠的糖水偏好比率下降，出現(xiàn)高度統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（n=12,P＜0.001），體重增長緩慢，出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（n=12,P＜0.05）,曠場下的活動(dòng)總路程沒有差異（n=12,P＞0.

14、05）,經(jīng)過21天的氟西汀治療后，氟西汀注射組大鼠的糖水偏好比率較鹽水注射組大鼠增加，表現(xiàn)為明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（n=12,P＜0.01）,而體重變化與曠場活動(dòng)總路程沒有變化（n=12,P＞0.05）。CUMS大鼠VTA多巴胺能神經(jīng)元自發(fā)放電頻率較對(duì)照組大鼠明顯增加，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）,簇狀放電增加，表現(xiàn)為高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）；經(jīng)過21天氟西汀治療后，氟西汀治療組大鼠的VTA多巴胺能神經(jīng)元自發(fā)放電頻率較CUMS組

15、大鼠降低，但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但較對(duì)照組大鼠表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。氟西汀治療組大鼠VTA多巴胺能神經(jīng)元簇狀放電活動(dòng)中動(dòng)作電位的數(shù)量相比較CUMS降低，表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；較對(duì)照組大鼠仍然增加，表現(xiàn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；而簇狀放電的持續(xù)時(shí)間同CUMS組大鼠比較沒有差異，同對(duì)照組大鼠比較表現(xiàn)為高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）（n=61(control);n=58(CUMS);n=83(CUMS+fluox

16、etine)）。
　　結(jié)論：
　　1.在慢性疼痛和慢性應(yīng)激（CUMS）誘發(fā)的兩種抑郁癥模型大鼠中，中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）多巴胺能神經(jīng)元電信號(hào)都發(fā)生改變。該研究提示，慢性應(yīng)激（疼痛或者刺激）導(dǎo)致的VTA腦區(qū)多巴胺能神經(jīng)元興奮性改變，與抑郁癥的發(fā)生具有很強(qiáng)的相關(guān)性。
　　2.慢性疼痛誘發(fā)抑郁癥狀的模型大鼠中，超極化激活的環(huán)核苷酸離子通道蛋白（HCN）的表達(dá)高調(diào)。由于HCN在神經(jīng)元的興奮性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用，本研究提示，