Sodium Benzoate對多巴胺能神經(jīng)元的毒性作用及機制研究.pdf

1、目的： 苯甲酸鈉(sodium benzoate，SB)，即苯甲酸的鈉鹽，是目前我國乃至全世界普遍采用的食品和飲料防腐劑之一，近年來的研究對其生物安全性不斷提出了新的質(zhì)疑。而SB的神經(jīng)毒性尤其是對于多巴胺能神經(jīng)元的毒性目前尚未見研究報道。本課題以斑馬魚為活體模型，觀察SB對多巴胺能神經(jīng)元早期發(fā)育的影響及相關(guān)的行為學變化；并以大鼠PC12腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞作為體外模型，觀察SB對哺乳動物多巴胺能神經(jīng)元的損傷以及在此條件下細胞MA

2、PK信號通路活化表達的特點，為進一步了解SB的神經(jīng)毒性及相關(guān)的分子機制提供實驗依據(jù)。 實驗方法： 1.成年斑馬魚的繁殖飼養(yǎng)及受精卵的生產(chǎn)、孵化：成年斑馬魚按照標準程序飼養(yǎng)，水溫在28.5℃，光照/黑暗周期(h)14：10；斑馬魚胚胎通過自然交配獲得，并在28.5℃的卵水中進行孵化； 2.通過形態(tài)學觀察檢測SB對2hpf胚胎的發(fā)育毒性影響：將胚胎暴露于不同濃度的SB(0～800μg/ml)并持續(xù)不同的暴露時間，每隔

3、24h統(tǒng)計生存率及畸形發(fā)生情況； 3.通過整體原位雜交檢測TH和DAT mRNA在3dpf斑馬魚胚胎中的表達，以及利用整體免疫熒光檢測TH蛋白在3dpf斑馬魚胚胎中的表達，來比較SB和MPTP對斑馬魚間腦腹側(cè)DA能神經(jīng)元的損傷作用； 4.通過行為學檢測觀察SB對6dpf斑馬魚幼魚活動能力的影響； 5.大鼠PC12腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞的培養(yǎng)、傳代，及生物學特性研究：PC12細胞培養(yǎng)于含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中

4、，至90％融合時用胰酶消化，調(diào)節(jié)細胞密度為(3～5)×105/ml傳代；分別計數(shù)培養(yǎng)0～8d的細胞數(shù)，并繪制細胞生長曲線，計算細胞群體倍增時間； 6.利用免疫熒光法檢測PC12細胞中NF200及TH的表達； 7.饑餓同步化處理后的第3～4代細胞，通過形態(tài)學觀察SB對PC12細胞形態(tài)發(fā)育的影響；用MTT法檢測SB對PC12細胞活性的影響；通過Western blot的方法觀察不同濃度(10～50mM) SB作用對PC12細

5、胞TH表達水平的影響；進一步用DAPI染色和流式細胞術(shù)證實SB可誘導PC12細胞發(fā)生凋亡，并比較不同濃度(10～50mM) SB所致PC12細胞凋亡率的差異； 8.用Western blot方法檢測不同濃度(10～50mM) SB作用于PC12細胞24h后，JNK和ERK磷酸化水平的變化；以及40mM SB作用于PC12細胞(0～24h)后，JNK和ERK磷酸化水平的變化； 9.用Western blot方法檢測JNK的

6、特異性抑制劑SP600125預處理30min，再加入SB分別作用1h和3h后，JNK和ERK磷酸化水平的變化。 結(jié)果： 1.建立了適合本實驗室條件的斑馬魚繁育系統(tǒng)，并能順利獲得滿足下游實驗要求的高質(zhì)量的受精卵； 2.在斑馬魚胚胎發(fā)育的各個時期，低濃度SB(40μg/ml)處理后未見明顯降低胚胎的生存率(P>0.05)；然而，隨著SB暴露持續(xù)時間的延長以及濃度的增加(從100到800μg/ml)，生存率明顯降低；

7、 3.SB暴露能夠引起心包浮腫、卵黃囊再吸收遲緩、卵黃囊水腫、體長縮短、脊柱彎曲等明顯的畸形改變；同時，胚胎的畸形率隨著SB濃度的增加而增加； 4.斑馬魚胚胎暴露于不同濃度的SB(40和100μg/ml)至3dpf能夠明顯下調(diào)TH基因在腹側(cè)間腦神經(jīng)元中的表達(對照組100±7.2％比51.42±4.1％和36.78±4.59％，分別以40和100μg/ml SB處理；P<0.001，與對照組相比)；與40μg/ml SB處

8、理組相比，100μg/ml組的作用明顯更為劇烈(P<0.001)；在陽性對照組中，MPTP(45μg/ml)能夠明顯下調(diào)TH基因在腹側(cè)間腦神經(jīng)元的表達(P<0.001，與對照組相比)；與TH的轉(zhuǎn)錄表達模式一致，在免疫熒光檢測中SB同樣使TH蛋白在間腦神經(jīng)元中的表達明顯降低； 5.與觀察到的SB誘導TH表達下調(diào)一致的是，SB同樣能夠誘導腹側(cè)間腦神經(jīng)元中DAT的表達發(fā)生明顯下調(diào)(對照組100±8.8％比56.44±8.8％、41.1

9、3±3.9％、48.83±7.3％，分別對應于40μg/ml SB、100μg/ml SB，和45μg/ml MPTP處理；P<0.001，與對照組相比)；并且SB100μg/ml的下調(diào)作用比40μg/ml組要更為嚴重(P=0.002)； 6.SB的暴露處理引起斑馬魚幼魚活動能力的明顯降低(P<0.001，與對照組相比)；且在相同濃度SB暴露狀態(tài)下，SB的早期暴露要比晚期暴露的作用影響更為明顯(P<0.001)； 7.普

10、通培養(yǎng)條件下的PC12細胞貼壁生長，胞體較小，胞核大，圓形，多為單核，偶可見雙核或核分裂相，核漿比大，有較多突起；體外培養(yǎng)的PC12細胞群體倍增時間為(24.71±0.59)h；免疫熒光顯示，PC12細胞NF200和TH的表達均為陽性； 8.SB可呈時間和濃度依賴性降低細胞活性；其中40mM SB作用24h后對PC12細胞的活性抑制率為47.81±5.23％； 9.低濃度(10mM)的SB可增強PC12細胞中TH的表達，

11、而高濃度(40～50mM)的SB則可降低TH的表達；同時，SB可呈時間依賴性降低TH的表達； 10.SB可誘導PC12細胞核形態(tài)呈凋亡改變；進一步利用FACS檢測，可發(fā)現(xiàn)細胞凋亡所形成的亞二倍體凋亡峰，其峰值隨SB濃度的增加而增加； 11.SB以濃度依賴性增加PC12細胞JNK的磷酸化水平，同時以濃度依賴性方式降低細胞中ERK的磷酸化水平； 12.40mM SB作用(0～24h)，1h時即引起JNK的磷酸化，3h

12、達到高峰，6h時雖略有下降，但仍明顯高于對照組，隨后的時間里又持續(xù)高表達；而同樣處理條件下，ERK的磷酸化水平在6h時突然降低，此后的時間里雖稍有增加，但仍低于對照組水平； 13.JNK抑制劑SP600125的預處理，在SB作用1h時能明顯降低SB所致的JNK的磷酸化水平增加；但到3h時，SP600125對JNK的激活抑制作用已無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；不過，SP6000125的預處理，短時間內(nèi)(3h)對SB作用下的PC12

13、細胞ERK的磷酸化無明顯影響。 結(jié)論： 1.SB的暴露處理導致斑馬魚胚胎的生存率以時間和濃度依賴性的方式明顯降低，同時畸形率呈濃度依賴性增加； 2.SB能夠誘導斑馬魚胚胎間腦DA能神經(jīng)元TH和DAT的表達明顯下調(diào)；并且這種DA能神經(jīng)元基因的表達下調(diào)呈濃度依賴性； 3.SB的暴露處理會引起斑馬魚幼魚活動能力的明顯下降，并且這種下降與暴露時期相關(guān)； 4.SB能夠抑制PC12細胞的增殖，影響多巴胺的合成