多巴胺能神經(jīng)元軸突變性在MPTP誘導(dǎo)的帕金森病模型中的作用研究.pdf

1、帕金森病是一種目前發(fā)病率較高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，近年來其發(fā)病率呈明顯上升趨勢，并且有年輕化發(fā)展的趨勢，現(xiàn)有的流行病學(xué)調(diào)查顯示其在50歲以上人群中的發(fā)病率約為1％。目前帕金森病的發(fā)病機(jī)制仍不明確，或許源于帕金森病患者腦組織內(nèi)多巴胺水平的明顯下降，中腦部位多巴胺神經(jīng)元胞體的變性一直是帕金森病發(fā)病機(jī)制研究中的熱點。但越來越多的研究卻表明，相較于神經(jīng)元胞體的變性及壞死，多巴胺能神經(jīng)元軸突的損傷可能在帕金森病的發(fā)病中發(fā)揮了更為重要的作用。神

2、經(jīng)元的軸突變性是指外源性或者內(nèi)源性的損傷因素作用于神經(jīng)元或者軸突后軸突所表現(xiàn)出的損傷過程，如局部腫脹、軸突斷裂等等，嚴(yán)重的軸突損傷會導(dǎo)致軸突內(nèi)細(xì)胞骨架成分的崩解及連續(xù)性喪失。在既往的研究中，軸突損傷及變性并未被人們作為一個獨立的過程而加以研究及對待，而是以神經(jīng)元胞體損傷的伴隨產(chǎn)物而加以研究，因此關(guān)于軸突損傷的報道局限于其是一種胞體損傷后的被動反應(yīng)。然而隨著研究的進(jìn)一步發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)軸突變性不僅僅是一種被動的反應(yīng)，更是軸突對損傷因素的一種

3、主動反應(yīng)過程，并且該過程會逆行性的影響到神經(jīng)元胞體，因此，防止軸突變性在維護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能的完整性上可能發(fā)揮了更為重要的作用。在帕金森病模型中，作為多巴胺能神經(jīng)元軸突投射部位的紋狀體，其損傷時間要明顯早于中腦部位神經(jīng)元胞體本身，且其損傷程度更甚。而作為一個獨立的病理過程，軸突損傷的持續(xù)存在則會進(jìn)一步逆行性加重胞體的損傷。因此軸突變性在帕金森病發(fā)病中的作用和地位可能需要重新審視。因此將多巴胺能神經(jīng)元軸突變性作為一個新的突破口可能

4、會對帕金森病發(fā)病機(jī)制的研究帶來一個新的突破。
　　第一部分：MPP+誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元軸突變性的研究
　　目的：通過1-甲基-4-苯基-四氫吡啶離子(MPP+)對多巴胺能神經(jīng)元的選擇性的毒性作用，體外原代培養(yǎng)小鼠多巴胺能神經(jīng)元，應(yīng)用亞致死劑量MPP+持續(xù)作用于神經(jīng)元，在離體實驗中觀察多巴胺能神經(jīng)元軸突變性情況，并進(jìn)一步探討神經(jīng)元胞體損傷與軸突變性的關(guān)系。
　　方法：選擇C57BL/6小鼠胚胎(孕14d)中腦腹側(cè)組織進(jìn)

5、行多巴胺能神經(jīng)元原代培養(yǎng),。實驗分為對照組及10.0μM MPP+藥物實驗組（亞致死劑量MPP+的濃度為預(yù)實驗獲得）。酪氨酸羥化酶（TH)可以選擇性的標(biāo)記多巴胺能神經(jīng)元，因此本研究中采用TH染色對多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行標(biāo)記。通過熒光顯微鏡及共聚焦顯微鏡對TH染色陽性神經(jīng)元胞體的數(shù)量、突起數(shù)目和長度分別在1h、2h、4h、8h、12h、24h共6個時間點進(jìn)行實驗觀察，應(yīng)用TUNEL染色確定凋亡神經(jīng)元,應(yīng)用APP染色法進(jìn)一步明確軸突損傷的情況。

6、
　　結(jié)果：在MPP+作用的早期（2h內(nèi)），TH染色陽性神經(jīng)元軸突開始出現(xiàn)了損傷表現(xiàn)，如軸突局部出現(xiàn)不規(guī)則膨大，順應(yīng)性變差，形態(tài)不規(guī)則等等，并且隨藥物作用時間的逐漸延長，熒光顯微鏡下可見TH染色陽性的神經(jīng)元軸突交匯而成的網(wǎng)狀交織密度開始逐漸下降，而軸突本身出現(xiàn)走形迂曲，變細(xì)縮短，甚至出現(xiàn)串珠樣變，嚴(yán)重者軸突崩解，作用24h后，大部分神經(jīng)元突起消失，部分僅殘存突起根部，神經(jīng)元胞體空虛形狀不規(guī)則。對比對照組，在10μM MPP+作用后

7、4h，神經(jīng)元突起的數(shù)量開始下降（P<0.05）并且損傷程度隨作用時間而加重，24h后，突起的數(shù)量下降了71%；對比對照組，MPP+作用后12h內(nèi)神經(jīng)元胞體的形態(tài)無明顯改變且數(shù)量無明顯變化（P>0.05），但24h后，神經(jīng)元數(shù)量相較對照組下降了40%且胞體形狀不規(guī)則。應(yīng)用TUNEL染色示，2組相比較，MPP+作用后前12h內(nèi)，二者凋亡細(xì)胞的數(shù)量并無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；而隨著MPP+作用時間的進(jìn)一步延長（24h后），相較于對照組

8、，MPP+處理組凋亡神經(jīng)元的數(shù)量增加了29%。應(yīng)用 APP染色法觀察軸突損傷可見，APP表達(dá)逐漸升高，且在初期其可見APP表達(dá)升高并在局部聚集。
　　結(jié)論：亞致死劑量的MPP+作用于多巴胺能神經(jīng)元，可避免大量的多巴胺能神經(jīng)元在短期內(nèi)大量的死亡，能夠更好的的模擬臨床上帕金森病發(fā)病的病理過程，在10μM亞致死劑量的 MPP+作用下，多巴胺神經(jīng)元突起的進(jìn)行性損傷較神經(jīng)元胞體損傷發(fā)生的更早且程度更為嚴(yán)重，這提示我們相較于胞體，神經(jīng)元突起對

9、外界的損傷因素更為敏感并且其可能作為一種對外界刺激做出的主動反應(yīng)參與了神經(jīng)元損傷的病理過程。
　　第二部分：MPTP誘導(dǎo)的C57BL小鼠軸突損傷的研究
　　目的：應(yīng)用MPTP腹腔注射C57BL小鼠建立慢性帕金森模型。觀察在此過程中小鼠中腦部位多巴胺能神經(jīng)元胞體損傷的情況，及相應(yīng)的紋狀體投射部位的變化，探討多巴胺能神經(jīng)元軸突變性在帕金森病發(fā)病中的作用，同時進(jìn)一步明確多巴胺能神經(jīng)元胞體變性及軸突變性二者的關(guān)系。
　　方法：

10、大齡雄性C57BL小鼠110只，按照給藥次數(shù)的不同隨機(jī)分為11組（0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10），每組10只。MPTP注射方法為腹腔注射30mg/kg，頻次為3天一次。MPTP注射后12h，相應(yīng)組別的小鼠被處死，行中腦及紋狀體部位組織TH染色及FJC染色，觀察TH染色陽性神經(jīng)元胞體及軸突的損傷及變性情況；同時行透射電鏡檢查觀察相應(yīng)的超微結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)果：第3次MPTP給藥后，小鼠開始出現(xiàn)步姿不協(xié)調(diào)，行為緩慢等行

11、為學(xué)改變，并且隨著給藥次數(shù)的增加而逐漸加重。TH染色結(jié)果示：正常對照組及第一次MPTP給藥組，在SNc及VTA區(qū)域均觀察到了TH-ir的細(xì)胞，其胞體飽滿，軸突長且直，細(xì)胞排列整齊。第二次MPTP注射后，SNc部位的TH-ir細(xì)胞的突起開始變短變細(xì)并出現(xiàn)不規(guī)則的局部腫大，部分TH染色陽性軸突出現(xiàn)明顯的串珠樣改變，但其相對應(yīng)的神經(jīng)元胞體完整，形狀規(guī)則，形態(tài)學(xué)觀察未見明顯異常。隨著給藥次數(shù)的增加，軸突損傷的程度進(jìn)行性加重且出現(xiàn)胞體損傷。10次

12、給藥后，SNc部位僅有少量TH-ir細(xì)胞，且其突起基本上全部消失。定量結(jié)果顯示紋狀體部位TH-ir纖維相對光密度值（OD）自第二次給藥后開始降低（P<0.05）且隨給藥次數(shù)增加而進(jìn)行性加重，而黑質(zhì)致密部 TH染色陽性細(xì)胞數(shù)量的下降則在發(fā)生時間上相對較晚，第四次MPTP注射后相較于對照組有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。10次MPTP注射后，相對于對照組，紋狀體TH-ir纖維的OD值下降64%,同時SNc處TH-ir細(xì)胞數(shù)量下降47%。FJC

13、染色示：第三次MPTP注射后在SNc處開始出現(xiàn)FJC-ir細(xì)胞，并且細(xì)胞數(shù)量隨給藥次數(shù)的增加而逐漸增多。FJC染色陽性神經(jīng)元細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上呈現(xiàn)出單一的胞體部分，而并未見明顯的神經(jīng)元突起，或僅殘留有少量的突起根部。透射電鏡示：在MPTP注射的早期，神經(jīng)元胞體的超微結(jié)構(gòu)并未出現(xiàn)明顯的變化，但是其對應(yīng)的軸突卻出現(xiàn)了較為明顯的超微結(jié)構(gòu)的改變：如軸突呈現(xiàn)不規(guī)則的腫脹，內(nèi)部的骨架結(jié)構(gòu)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)紊亂甚至崩解消失等現(xiàn)象，并且隨 MPTP腹腔注射次數(shù)的增加

14、，相應(yīng)的軸突損傷的程度進(jìn)一步加重，直至出現(xiàn)軸突斷裂消失。
　　結(jié)論：腹腔多次注射MPTP誘導(dǎo)的C57BL小鼠帕金森模型中，TH染色陽性軸突損傷在發(fā)生時間上要遠(yuǎn)早于胞體的損傷，而在損傷程度上，軸突的損傷則更為嚴(yán)重，因此這就提示軸突損傷可能是其對外界因素的一種獨立反應(yīng)，其在PD發(fā)病中的作用可能獨立于胞體損傷之外并發(fā)揮了重要作用。
　　第三部分：MPTP誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元軸突變性機(jī)制的研究
　　目的：利用MPP+作用于原代

15、培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞及MPTP腹腔注射誘導(dǎo)的C57BL小鼠慢性帕金森模型，利用細(xì)胞骨架帶白β-TubulinⅢ的檢測進(jìn)一步定量軸突損傷，并揭示Akt/GSK-3β/CRMP-2信號通路是否參與了此過程，為PD的發(fā)病機(jī)制提供新的依據(jù)。
　　方法：通過免疫印跡實驗分析MPP+作用后，在不同時間點的Akt，GSK-3β及CRMP-2的表達(dá)及其磷酸化水平。應(yīng)用western blot及免疫熒光染色分析β-TubulinⅢ的表達(dá)水平。為

16、進(jìn)一步明確Akt/GSK-3β/CRMP-2在軸突變性中的作用，在小鼠模型及體外培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元中應(yīng)用Akt的抑制劑LY294002，通過TH及FJC染色觀察其對MPTP及MPP+對軸突損傷的作用，并通過western blot分析進(jìn)一步分析Akt，GSK-3β及CRMP-2的表達(dá)及其磷酸化水平，應(yīng)用western blot及免疫熒光染色分析β-TubulinⅢ的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：在亞致死濃度MPP+（10μM）作用下，p

17、-Akt和p-GSK-3β在作用1h后出現(xiàn)明顯下降，而在MPP+作用2小時，其二者的表達(dá)水平開始逐漸增高并于4 h達(dá)到最高峰，然后在8h，12h和24h再次下降。而p-CRMP-2在給藥后1小時開始增加，2小時后下降并于4小時達(dá)到最低水平，8h，12h和24h較4h時表達(dá)升高但仍維持在較低水平。同時，在整個過程中，我們發(fā)現(xiàn)總Ak，GSK-3β及CRMP-2無顯著變化。β-tubulinIII在MPP+作用1小時后開始下降，且在整個24h

18、的作用時間內(nèi)持續(xù)性降低。應(yīng)用Akt的阻斷劑LY294002后，經(jīng)過10次的 MPTP和LY294002作用的C57BL小鼠其TH-ir神經(jīng)元數(shù)量相較于MPTP組下降了約27％，而紋狀體TH-ir纖維的OD值下降了35％。同時聯(lián)合應(yīng)用LY294002和MPTP給藥十次后，SN部位的FJC-ir神經(jīng)元較MPTP處理組顯著增加（23％）。體外實驗中，我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用LY294002及MPP+增加了多巴胺能神經(jīng)元軸突損傷的程度。作用4h后，和M

19、PP+處理組相比，軸突的數(shù)量減少17％，而神經(jīng)元的數(shù)量和對照組及 MPP+相比并沒有顯著的變化相比。作用24小時后，相較于MPP+處理組，神經(jīng)元的數(shù)量減少了22％，軸突的數(shù)量下降了15%。同時我們在聯(lián)合應(yīng)用MPP+及LY2940024h的時間點測量了Akt，GSK-3β，CRMP-2及β-tubulinIII的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，作用4h后，LY294002可以使p-Akt及p-GSK3β表達(dá)下降，同時使p-CRMP-2的表達(dá)增高，β-tu