軸突及軸突終末變性與再生在C57BL小鼠帕金森病模型中的作用研究.pdf

1、目的:1、本實驗通過建立MPTP誘導的C57BL小鼠PD急性、亞急性及慢性動物模型，探討軸突變性在中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性中所起的作用，以及軸突變性對紋狀體多巴胺含量的影響，判斷軸突及軸突終末變性與多巴胺能神經(jīng)元變性之間的相互關系及發(fā)生的先后順序；2、通過建立急性、亞急性及慢性PD動物自發(fā)恢復模型，探討軸突及軸突終末“出芽”再生在PD動物模型恢復中所起的作用，以及軸突及軸突終末“出芽”再生對紋狀體DA含量的影響，判斷PD動物模型自發(fā)恢

2、復時DAG神經(jīng)元胞體及軸突、軸突終末的主要形態(tài)學改變；3、通過建立急性、亞急性及慢性PD模型自發(fā)恢復后再損傷模型，探討軸突及軸突終末變性在再損傷中所起的作用及其機制。為PD發(fā)病機制及恢復機制的研究、PD的預防、治療和康復提供實驗依據(jù)。方法與結(jié)果:第一部分實驗（MPTP誘導C57BL小鼠PD模型多巴胺能神經(jīng)元及軸突的損傷）：大齡C57BL小鼠55只（32-34w），按給與MPTP的劑量、間隔時間及持續(xù)時間不同隨機分為4組：對照組、急性組、

3、亞急性組和慢性組，依據(jù)PD小鼠出現(xiàn)癥狀的嚴重程度及行為學檢測（包括爬桿實驗、游泳實驗、懸掛實驗及提尾倒立實驗）結(jié)果，確定PD動物模型臨床分期（包括臨床前期、臨床早期、臨床中期及臨床晚期）。各組中分別于臨床前期、臨床早期、臨床中期及臨床晚期各處死三只模型小鼠，一只行中腦黑質(zhì)致密部及紋狀體免疫組化染色（包括TH染色、FJC染色）觀察多巴胺能神經(jīng)元胞體及紋狀體神經(jīng)纖維、軸突終末的變性、壞死情況；一只進行透射電鏡檢查中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元胞體及

4、其投射到紋狀體的軸突及軸突終末、突觸的超微結(jié)構變化情況，一只用高效液相色譜儀-液質(zhì)聯(lián)用法檢測紋狀體內(nèi)DA、HVA及DOPAC的含量。結(jié)合小鼠出現(xiàn)PD癥狀的早晚，動態(tài)觀察、比較黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元胞體、軸突、樹突及其投射到紋狀體的軸突、軸突終末、突觸等結(jié)構那一個先發(fā)生變性、壞死，變性的程度及先后順序。結(jié)果：各組模型均先后出現(xiàn)了PD的癥狀，并逐漸加重；隨臨床分期的逐漸加重，PD模型小鼠黑質(zhì)TH-ir神經(jīng)元數(shù)目進行性減少，與對照組比較，臨

5、床前期、臨床早期、臨床中期及臨床晚期分別下降29.6％、44.5％、66.7％及78.4％；DA及DOPAC、HVA含量也呈逐漸下降趨勢，紋狀體內(nèi)DA含量分別下降為56.3％、71.5％、84.1％及91.3％，模型組TH-ir細胞計數(shù)結(jié)果及紋狀體DA含量與正常對照組比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），紋狀體內(nèi)TH-ir神經(jīng)纖維積分光密度值進行性下降。MPTP小鼠PD模型不但SNc內(nèi)TH-ir神經(jīng)元細胞數(shù)目明顯減少，而且TH-ir細胞的

6、軸突及樹突數(shù)目減少及損害程度要嚴重于細胞數(shù)目的減少及損害，神經(jīng)纖維纖細且短，嚴重者甚至軸突完全消失。模型組中臨床前期及臨床早期小鼠的殘留DAG神經(jīng)元細胞軸突表現(xiàn)為軸突變細，長度縮短，粗細不均勻呈串珠樣改變，并且走行迂曲，有軸漿運輸障礙表現(xiàn)。FJC染色陽性細胞僅出現(xiàn)在MPTP小鼠模型黑質(zhì)致密部，細胞計數(shù)結(jié)果是急性模型＞亞急性模型＞慢性模型，JFC陽性細胞僅保留有變性的細胞體，軸突及樹突未顯示，僅個別細胞出現(xiàn)殘存的軸突根部，提示變性細胞的軸

7、突及樹突已先于胞體變性、消失，不能被FJC染色。透射電鏡檢查結(jié)果：在臨床前期或臨床早期階段，PD模型黑質(zhì)內(nèi)DAG神經(jīng)元超微結(jié)構及細胞器形態(tài)均正常的情況下，紋狀體內(nèi)DAG神經(jīng)元軸突已經(jīng)出現(xiàn)變性的早期表現(xiàn)，如局部膨大，膨大處線粒體腫脹變形，線粒體嵴不清甚至消失，出現(xiàn)空泡化，軸突局部膨大處神經(jīng)微管及神經(jīng)微絲結(jié)構紊亂，不連續(xù)，有微管解聚表現(xiàn)，提示軸突變性在先，而DAG神經(jīng)元胞體的變性在后。第二部分實驗（MPTP誘導C57BL小鼠PD模型多巴胺能

8、神經(jīng)元及軸突、軸突終末損傷后的自發(fā)恢復）：低齡C57BL小鼠55只（6-8w）隨機分為對照組、急性組、亞急性組和慢性組。PD動物模型建立成功后觀察其行為學有無自發(fā)恢復現(xiàn)象，并再次進行行為學測試確定恢復時期的臨床分期，分別于各期處死3只小鼠模型，行中腦黑質(zhì)致密部及紋狀體免疫組化染色（包括TH染色、FJC染色）觀察多巴胺能神經(jīng)元胞體及紋狀體神經(jīng)纖維、軸突終末的變性、壞死情況及再生情況；3只測紋狀體DA、HVA及DOPAC的含量；3只進行透射

9、電鏡檢查中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元胞體及其投射到紋狀體的軸突、軸突終末、突觸的超微結(jié)構變化情況，并分別與第一部分實驗中臨床晚期、臨床中期、臨床早期及臨床前期的電鏡結(jié)果比較，觀察黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元胞體、胞內(nèi)細胞器及其投射到紋狀體的軸突、軸突終末及突觸的變化情況，恢復再生情況。結(jié)合模型小鼠恢復情況，動態(tài)觀察、比較SNc內(nèi)DAG神經(jīng)元細胞數(shù)、胞體、軸突、樹突、突觸及紋狀體TH-ir神經(jīng)纖維積分光密度值變化情況，觀察紋狀體DA的含量是否隨癥狀的緩

10、解而逐漸升高，并且觀察DA含量的升高與SNc內(nèi)DAG神經(jīng)元胞體的恢復及投射到紋狀體的軸突、軸突終末的再生有無關系。結(jié)果：急性模型及慢性模型組中動物PD癥狀能達到臨床晚期的比率較亞急性要高，急性模型幾乎均有自發(fā)恢復現(xiàn)象（恢復率100％），恢復的程度也明顯高于另外兩種模型；慢性模型PD癥狀比較典型，但該型模型一旦建立成功，自發(fā)恢復現(xiàn)象不明現(xiàn)，有逐漸加重的趨勢。恢復期雖然PD模型臨床分期在好轉(zhuǎn)，紋狀體內(nèi)DA含量隨臨床分期好轉(zhuǎn)逐漸升高，與對照組

11、比較，從臨床晚期到臨床前期，恢復率分別為10.7％、35.1％、44.8％和67.5％。但TH-ir細胞數(shù)卻仍然在逐漸減少，與對照組比較，臨床晚期減少76.3％，恢復到臨床中期、早期及前期時分別減少78.4％、82.4％和85.2％。PD小鼠模型恢復期紋狀體區(qū)TH-ir神經(jīng)纖維積分光密度值隨PD模型臨床分期的恢復呈逐漸增高趨勢（最低是臨床晚期的小鼠）。MPTP小鼠PD模型從臨床晚期自發(fā)恢復到臨床前期時TH染色，雖然殘存細胞總數(shù)少于臨床晚

12、期，但胞體增大，飽滿，細胞形態(tài)恢復到正常的梭形或多角形，胞漿豐富，核仁居中，胞體軸突及樹突粗大，數(shù)量多，TH-ir纖維密集粗大成束，走行流暢規(guī)律，說明胞體及軸突形態(tài)明顯改善，可能是殘存的軸突及軸突終末通過側(cè)支“出芽”方式再生，恢復了正常的直徑。小鼠PD模型自發(fā)恢復到臨床早期及臨床前期的FJC染色結(jié)果：SNc內(nèi)僅有少量的FJC陽性細胞，胞體皺縮，體積縮小，形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，與剛變性死亡的細胞形態(tài)基本接近正常細胞形態(tài)不同。電鏡結(jié)果：DA

13、G神經(jīng)元胞體形態(tài)大小恢復，細胞質(zhì)中細胞器較豐富，可見豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體及數(shù)量較多的線粒體，脂褐素較少，有自噬泡出現(xiàn)，細胞核大呈卵圓形，核膜清晰完整，皺褶消失；紋狀體內(nèi)突觸數(shù)量明顯增多，且突觸的數(shù)量恢復先于胞體結(jié)構的恢復，線粒體數(shù)量增多，形態(tài)及結(jié)構完整，線粒體嵴明顯；紋狀體內(nèi)軸突腫脹及局部膨大均消失，髓鞘及神經(jīng)微管、神經(jīng)微絲排列整齊，連續(xù)性好，密集，走行自然，未見斷裂及纏結(jié)，未見到髓鞘松解斷裂現(xiàn)象。恢復期中腦黑質(zhì)內(nèi)DAG神經(jīng)元胞

14、體及軸突的超微結(jié)構、紋狀體內(nèi)突觸數(shù)量恢復情況隨臨床分期的改善而逐漸好轉(zhuǎn)。第三部分實驗（MPTP誘導C57BL小鼠PD模型多巴胺能神經(jīng)元及軸突損傷自發(fā)恢復后再損傷）：低齡C57BL小鼠（6-8w）35只隨機分對照組、急性組、亞急性組及慢性組，注意觀察其行為學方面有無自發(fā)恢復現(xiàn)象，并再次進行行為學測試確定恢復時期的臨床分期。將從臨床晚期逐漸自發(fā)恢復到臨床早期或臨床前期的PD模型小鼠于癥狀穩(wěn)定后的第10～15天，再次按30mg/kg腹腔注射M

15、PTP一次，建立恢復后再損傷PD模型。觀察小鼠的行為學表現(xiàn)，于注射MPTP后第二天開始處死小鼠，一部分行中腦黑質(zhì)致密部及紋狀體免疫組化染色（包括TH染色、FJC染色）觀察多巴胺能神經(jīng)元胞體及紋狀體神經(jīng)纖維、軸突、軸突終末的變性、壞死情況；另外一部分檢測紋狀體內(nèi)DA、HVA及DOPAC的含量；另取一只進行透射電鏡檢查中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元胞體及其投射到紋狀體的軸突、軸突終末、突觸的超微結(jié)構變化情況，并分別與第一部分實驗中臨床晚期、臨床中期

16、、臨床早期、臨床前期及第二部分實驗中恢復期模型小鼠的電鏡結(jié)果比較，觀察黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元胞體、胞內(nèi)細胞器及其投射到紋狀體的軸突、軸突終末及突觸的變化情況，恢復再生情況及再損傷后的改變情況。結(jié)果：共有14只小鼠癥狀發(fā)展到臨床晚期，其中有8只出現(xiàn)自發(fā)恢復趨勢，分別恢復至臨床前期至臨床中期。再次腹腔注射MPTP一次，注射后小鼠的急性毒性反應較第一次注射時明顯減輕，但于注射10h后，迅速出現(xiàn)PD晚期的癥狀，于注射MPTP后3天開始死亡。紋狀體

17、內(nèi)DA、DOPAC、HVA的含量均急劇減少，與對照組比較，DA含量減少94.2％，DOPAC及HVA各下降了85.1％和76.8％；紋狀體區(qū)TH-ir神經(jīng)纖維積分光密度值與對照組比較極低；TH染色發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)致密部TH陽性細胞極少，僅6.5±0.6，較對照組減少91.9％；軸突及樹突不明顯，偶可見軸突根部殘留較短的突起，TH-ir纖維稀疏，走行紊亂；FJC染色示SNc內(nèi)僅有少量的陽性細胞，胞體形態(tài)仍接近正常細胞的梭形或不規(guī)則多角形，提示是剛

18、發(fā)生變性壞死的DAG神經(jīng)元細胞，胞體的基本形態(tài)尚存，但未見細胞軸突及樹突顯影。電鏡結(jié)果：MPTP小鼠PD模型自發(fā)恢復后再損傷時紋狀體內(nèi)DAG神經(jīng)元細胞的軸突髓鞘崩解，軸突內(nèi)神經(jīng)微管及神經(jīng)微絲結(jié)構嚴重紊亂，數(shù)量明顯減少，多數(shù)已斷裂，僅有少量的神經(jīng)微管連續(xù)，有解聚、崩解、斷裂現(xiàn)象，變性程度嚴重；軸突內(nèi)線粒體變性，線粒體嵴消失，出現(xiàn)崩解現(xiàn)象；紋狀體內(nèi)突觸數(shù)量明顯減少，殘存突觸結(jié)構形態(tài)縮小，突觸面寬度變窄。結(jié)論：1、MPTP所致的C57BL小鼠