小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí)calpain切割GSK-3β的研究.pdf

1、GSK—3β(glycogen synthase kinase—3β)是促神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵激酶。GSK—3β活性主要受自身N末端及C末端的磷酸化位點(diǎn)調(diào)控。當(dāng)Scr9被磷酸化后，N—末端可作為假底物與GSK—3β的R96位結(jié)合，從而抑制了GSK—3β的活性；同時(shí)GSK—3β的C末端的Ser389被P38MAPK直接磷酸化而抑制GSK—3β的活性，從而使β—catenin聚集，促進(jìn)細(xì)胞存活。因此，GSK—3β的Ser9及Ser389磷酸化具

2、有抑制GSK—3β活性的作用。 體外神經(jīng)元存活有賴于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以及一定的“電活性”；當(dāng)采用25mMKCI模擬體內(nèi)“電活性”，維持神經(jīng)元存活。當(dāng)KCI韻濃度換成5mM，神經(jīng)元發(fā)生典型的凋亡，此凋亡模型已被廣泛應(yīng)用于中樞神經(jīng)元凋亡機(jī)制的研究。此外，谷氨酸誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型也廣泛用于神經(jīng)元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究，一些關(guān)鍵的調(diào)控細(xì)胞凋亡的激酶已經(jīng)在谷氨酸凋亡模型被闡明：如PI3K/AKT、p38等。 我們觀察到：在撤鉀誘導(dǎo)

3、CGNs凋亡模型，GSK—3β的N端被calpain切割，并提示C端也被切割，但仍缺乏C端直接切割證據(jù)。calpain切割對(duì)調(diào)控GSK—3β的活性可能具有重要的生物學(xué)意義：因?yàn)?，缺少抑制性N—末端及C末端的GSK—3β，將可能不受上游激酶磷酸化的抑制，呈現(xiàn)組成性(constitutive)激活的特點(diǎn)。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，將可能揭示一種調(diào)控GSK—3β活性的新機(jī)制，即通過(guò)剪切N—末端及C—末端解除抑制的方式激活GSK—3β。 我們將在

4、前期工作上進(jìn)一步研究calpain切割對(duì)GSK—3β的調(diào)控：是否GSK—3βC端也被calpain直接切割？切割確切發(fā)生在GSK—3βN—末端及C末端的哪個(gè)氨基酸殘基？是否象預(yù)測(cè)一樣，切割產(chǎn)物tGSK—3β活性將變得更強(qiáng)或具有組成性激活的特點(diǎn)？tGSK—3β是否具有更強(qiáng)的促神經(jīng)元凋亡作用？這一切割調(diào)控是否具有普遍性？ 因此，本課題研究?jī)?nèi)容如下： 1、谷氨酸誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí)GSK—3β是否發(fā)生切割？是否N、C末端也

5、被切割？ 2、撤鉀誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí)GSK—3βC端是否也被切割？ 3、切割發(fā)生在GSK—3βN—末端及C末端的哪個(gè)氨基酸殘基？ 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果: 一、谷氨酸誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí)GSK—3β的被calpain切割。 1.谷氨酸誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型建立體外培養(yǎng)第7天的小腦顆粒神經(jīng)元，加入不同濃度的谷氨酸(10μM、30μM、50μM、70μM、100μM)，以血清做對(duì)照。加藥10mi

6、ns后用相差顯微鏡觀察神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化，可見(jiàn)血清組神經(jīng)元胞體飽滿透亮，軸突與樹(shù)突清晰而且完整，而谷氨酸刺激后，神經(jīng)元胞體出現(xiàn)腫脹變圓、變黑，樹(shù)突軸突斷裂，并隨著谷氨酸濃度的增加而逐漸明顯。處理24小時(shí)后，采用Hoechst33258、PI和FDA染色統(tǒng)計(jì)凋亡率，結(jié)果表明谷氨酸刺激使神經(jīng)元發(fā)生典型的凋亡，且凋亡率隨谷氨酸濃度增加而升高。以上表明成功建立了谷氨酸凋亡模型。 2.谷氨酸濃度梯度證實(shí)GSK—3β被切割建立谷氨酸模型，以不

7、同濃度的谷氨酸(10μM、30μM、50μM、70μM、100μM)，刺激DIV7的小腦顆粒神經(jīng)元24h，WB檢測(cè)GSK—3β的切割情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)谷氨酸刺激后GSK—3β發(fā)生切割。 3.時(shí)間梯度證實(shí)GSK—3β被切割以50μM作為谷氨酸中毒濃度，選擇不同的時(shí)間點(diǎn)(2h、4h、8h、12h、24h)，WB檢測(cè)GSK—3β，同樣觀察到GSK—3β發(fā)生了切割。同時(shí)檢測(cè)谷氨酸模型公認(rèn)被切割CRMP—4，可見(jiàn)隨著時(shí)間點(diǎn)的遞增，CRMP—4

8、切割逐漸增加，驗(yàn)證了模型的可靠性。 4.GSK—3β的N、C端被切割建立谷氨酸模型，以50μM谷氨酸刺激DIV7的小腦顆粒神經(jīng)元24h，用GSK—3β的N端抗體Geneway(21-36aa)和C端抗體G7914(403-420aa)檢測(cè)GSK—3β的切割情況，分別檢測(cè)到對(duì)應(yīng)的切割條帶，證實(shí)了GSK—3β的N、C端被切割。 5.calpain而非caspase—3介導(dǎo)GSK—3β的切割。 建立谷氨酸模型，并加入c

9、alpain抑制劑ALLM(50uM)觀察對(duì)GSK—3β切割的影響，結(jié)果表明ALLM很好抑制了GSK—3β切割的發(fā)生，證實(shí)calpain介導(dǎo)了GSK—3β的切割。 而同時(shí)我們?cè)诠劝彼崮Ｐ蜋z測(cè)了另一神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白酶Caspase—3，發(fā)現(xiàn)谷氨酸刺激小腦顆粒并未激活caspase—3，可以排除caspase—3介導(dǎo)切割GSK—3β。 二、撤鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí)GSK—3βC端也被切割我們前期研究發(fā)現(xiàn)，撤鉀誘導(dǎo)小腦

10、顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí)GSK—3β被切割，且利用識(shí)別GSK—3最C末端的抗體可以檢測(cè)到切割帶，表明GSK—3β的N端發(fā)生切割，但是由于缺乏識(shí)別GSK—3βN端豹抗體，因而無(wú)法證實(shí)GSK—3β的C端是否被切割。在本課題研究中，我們利用識(shí)別GSK—3β最N端的抗體檢測(cè)撤鉀誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時(shí)GSK—3β情況，觀察到GSK—3β的切割條帶，表明撤鉀凋亡時(shí)GSK—3βC端也被切割。 三、GSK—3β切割位點(diǎn)鑒定: 1、雙向電泳分離

11、Westernblotting提示GSK—3β的N、C端切割條帶以及calpain自切條帶相互重合，擬通過(guò)雙向電泳方法分離切割片段。His—GSK—3β體外切割，跑雙向電泳轉(zhuǎn)PVDF膜，用GSK—3中間抗體sc9166孵育，檢測(cè)蛋白斑點(diǎn)，未檢測(cè)到切割斑點(diǎn)。 2、Edman測(cè)序和質(zhì)譜鑒定位點(diǎn)His—GSK—3β體外切割，跑SDS—PAGE，轉(zhuǎn)膜PVDF，考染送切割條帶N端Edman測(cè)序，或者考染后切膠胰酶消化，質(zhì)譜TOF/TOF鑒