熊去氧膽酸對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用.pdf

1、研究目的： 建立過氧化氫誘導(dǎo)乳鼠小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型，研究熊去氧膽酸對(duì)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡是否具有保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討其可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 研究方法： 大鼠小腦顆粒神經(jīng)元的分離和原代培養(yǎng)，并建立過氧化氫誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元模型；以神經(jīng)元存活率、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、DNA凋亡梯帶等為指標(biāo)評(píng)價(jià)過氧化氫對(duì)小腦顆粒神經(jīng)元的凋亡性損傷作用，并觀察給予熊去氧膽酸預(yù)處理24小時(shí)后上述各指標(biāo)的變化。蛋白免疫印跡法(Western b

2、lotting，WB)分別檢測(cè)CREB、p-CREB、Caspase-3蛋白水平變化，JNK/c-Jun通路蛋白以及它們各自的磷酸化形式的水平；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse。transcriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)觀察c-Jun基因mRNA水平的表達(dá)。探討熊去氧膽酸抗神經(jīng)元凋亡作用是否和上述蛋白的表達(dá)改變有關(guān)。 結(jié)果： 我在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，UDCA對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的小腦

3、顆粒神經(jīng)元凋亡有明顯的抑制作用，進(jìn)而從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度探討了CREB、JNK/c-Juni通路及caspses-3在UDCA抑制小腦顆粒神經(jīng)元凋亡中的作用。 1.MTT結(jié)果顯示，過氧化氫對(duì)小腦顆粒神經(jīng)元的損傷具有時(shí)間和劑量依賴性，隨著劑量的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)元的凋亡率增加。其中，過氧化氫100μM、沖擊30分鐘的作用模式最適合作為過氧化氫誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型。UDCA預(yù)處理可減少過氧化氫引起的神經(jīng)元凋亡，提高細(xì)胞存

4、活率。 2.從DNA凝膠電泳結(jié)果可看出，100μM、沖擊式作用30分鐘后再培養(yǎng)12小時(shí)，過氧化氫可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡梯帶的出現(xiàn)，1001μM UDCA預(yù)處理24小時(shí)能夠抑制過氧化氫誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元的凋亡。 3.通過觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、Hochest33258染色進(jìn)一步驗(yàn)證，100μM UDCA預(yù)處理24小時(shí)能夠明顯抑制過氧化氫誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元核固縮、碎裂。 4.WB結(jié)果顯示，過氧化氫100μM、沖擊30分鐘后

5、培養(yǎng)12小時(shí)內(nèi)，p-CREB的表達(dá)逐漸減少；Caspase-3的蛋白表達(dá)不變；在JNK/c-Jun通路中，p-c-Jun和c-Jun在過氧化氫沖擊后5分鐘開始升高，1小時(shí)左右達(dá)到最高。UDCA預(yù)處理可以明顯抑制H<,2>O<,2>刺激所引起的p-CREB減少，還可以抑制c-Jun和p-c-Jun表達(dá)的升高。對(duì)于c-Jun上游的p-JNK1/2、p-ERK1/2、p-P38的進(jìn)一步WB檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，p-ERK1/2、p-P38的表達(dá)無明顯變

6、化，而p-JNK1/2在過氧化氫100μM、沖擊30分鐘后5分鐘就達(dá)到峰值。UDCA預(yù)處理可以抑制p-JNK1/2蛋白表達(dá)的升高，說明UDCA可以通過抑制JNK1/2的活化進(jìn)而抑制c-Jun的磷酸化。 5.RT-PCR結(jié)果顯示，過氧化氫刺激使c-Jun的mRNA表達(dá)水平增高，而UDCA預(yù)處理可以抑制此增高。 結(jié)論： 1.適當(dāng)?shù)倪^氧化氫刺激可以在體外成功誘導(dǎo)出小腦顆粒神經(jīng)元的凋亡模型。凋亡的產(chǎn)生與p-CREB的降低