c-Fos保護(hù)小腦顆粒神經(jīng)元作用及其機制研究.pdf

1、AP-1蛋白由bZip(basic region—leuzinezip)家族成員形成的同二聚體或異二聚體組成，包括Jun，F(xiàn)os，ATF及Maf等亞家族。它們大部分是轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子除了含有典型的轉(zhuǎn)錄激活域和堿性DNA結(jié)合區(qū)(basic region)之外，還有一個特殊的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(leuzinezip)，這樣的結(jié)構(gòu)決定了它們必須形成二聚體才能結(jié)合到順式作用元件(cis—elements)上。研究表明c—Jun/ATF2形成

2、二聚體與靶基因啟動子的ATF位點結(jié)合；c—Jun/c—Fos主要結(jié)合經(jīng)典的TRE序列，因此，搭檔(partner)的不同決定了c—Jun異二聚體與靶序列結(jié)合的特異性，從而選擇性激活不同靶基因的表達(dá)。 c—Fos是AP-1蛋白家族的重要成員之一，其活性受多種因素調(diào)節(jié)，同時也參與多種生物學(xué)過程。c—Fos與許多生物學(xué)現(xiàn)象有關(guān)，如在成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖]和細(xì)胞周期；促進(jìn)許多細(xì)胞系的分化及參與調(diào)節(jié)軸突伸

3、長等。但c—Fos與神經(jīng)元凋亡的關(guān)系及其機制尚不明確。 小腦顆粒神經(jīng)元(cerebellar granule neurons，CGNs)在去極化濃度的KCl(25 mMKCl，25 K)培養(yǎng)下維持存活，當(dāng)換成低濃度KCl(5 mM KCl，5K)時，CGNs發(fā)生典型的凋亡。利用這一模型，我們前期的實驗結(jié)果證明：撤鉀誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時，c—Jun與ATF2形成二聚體與靶基因啟動子的ATF位點結(jié)合而觸發(fā)靶基因表達(dá)并介導(dǎo)神經(jīng)元凋

4、亡。通過結(jié)構(gòu)分析并結(jié)合文獻(xiàn)報道，我們發(fā)現(xiàn)，c—Fos與c—Jun的親和力要大于ATF2與c—Jun的親和力，那么c—Fos作為另一重要的AP-1蛋白，其存在對形成二聚體的c—Jun/ATF2及其介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡是否有影響？ 因此，本課題主要研究目的為： 1.闡明c—Fos表達(dá)對c—Jun/ATF2二聚體的影響。 2.研究c—Fos在小腦顆粒神經(jīng)元凋亡中的作用。 實驗方法和結(jié)果： 1.撤鉀誘導(dǎo)小腦顆

5、粒神經(jīng)元凋亡模型中，c—Fos表達(dá)下調(diào) c—Fos在神經(jīng)元中凋亡中的作用尚不明確，為研究其作用及機制，我們首先觀察它在小腦顆粒神經(jīng)元中的表達(dá)情況。體外培養(yǎng)7天的小腦顆粒神經(jīng)元，換液到含有去極化濃度即25 mM KCl(25 K)或復(fù)極化濃度即5 mM KCl(5 K)的培養(yǎng)基中孵育1、2、4小時，然后提取細(xì)胞總的RNA進(jìn)行RT—PCR，檢測c—fos mRNA的變化情況。檢測結(jié)果顯示，c—fos表達(dá)在5K處理1小時時即明顯下調(diào)

6、，隨著撤鉀時間延長，這種下調(diào)是持續(xù)的。同樣的，撤鉀時，c—Fos蛋白水平在1小時即急劇下調(diào)，而且這種下調(diào)一直持續(xù)至4小時，與mRNA變化完全一致，表明撤鉀誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的早期，c—Fos在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生下調(diào)。 已有報道，去極化誘導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，通過L型鈣通道維持去極化時c—Fos在神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)。我們分別采用了L型鈣通道抑制劑Nifedipine(Nif)和特異性Ca2+/calmodulin—dependent protein

7、kinases(CaMKs)抑制劑KN62(KN)，來驗證去極化時是否CaMKs介導(dǎo)了c—Fos的表達(dá)。小腦顆粒神經(jīng)元體外培養(yǎng)第7天，吸去完全培養(yǎng)基，用相應(yīng)5K、25K洗一遍，分別用SK、25K、25K+1μmol/L Nifedipine、25K+10μmol/L KN62處理，無抑制劑處理組，用終濃度小于1‰的DMSO(二甲基亞砜)做為溶劑對照。處理4小時后，提取細(xì)胞總的RNA進(jìn)行RT—PCR，檢測c—fosmRNA的變化情況。結(jié)果

8、提示：CaMKs介導(dǎo)了去極化誘導(dǎo)的c—fos mRNA變化。抑制CaMKs活性觀察c—Fos蛋白變化，得到與mRNA相一致的結(jié)果。 2.c—Fos干擾c—Jun/ATF2二聚體形成 我們前期研究表明c—Jun/ATF2形成異二聚體并介導(dǎo)了神經(jīng)元的凋亡，那么同為AP-1家族蛋白的c—Fos在其中發(fā)揮怎樣的作用？通過對c—Jun ATF2及c—Fos的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，由于其亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域中參與形成二聚體的關(guān)鍵位點上殘基的帶電

9、性不同，c—Fos與c—Jun的親和力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于ATF2同c—J un的親和力，其突變體A—Fos與c—Jun親和力則更高。在撤鉀時，c—Jun和ATF2被激活并表達(dá)增加，與之相反的，c—Fos卻急劇下調(diào)，由此我們提出：c—Fos的下調(diào)是否有利于c—Jun/ATF2二聚體才形成？反之，c—Fos的存在是否干擾c—Jun/ATF2二聚體形成？ 為證實這個設(shè)想，我們采用競爭性CoIP實驗：HEK293細(xì)胞融合度達(dá)到90％時，用脂質(zhì)體

10、轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染V5-C2/c—Jun、Flag—C2/ATF2質(zhì)粒，加或不加質(zhì)粒Flag—c—Fos或Flag—A—Fos。36小時后，收集細(xì)胞做免疫共沉淀，用V5抗體進(jìn)行IP后，Western blot用Flag抗體檢測C2/ATF2、c—Fos、A—Fos及C2/c—Jun表達(dá)量。結(jié)果顯示：IP C2/c—Jun檢測到C2/ATF2，說明C2/c—Jun和C2/ATF2形成了二聚體，加入c—Fos或A—Fos后沉淀復(fù)合物中的C2/AT

11、F2明顯減弱，有力地證明了c—Fos或A—Fos競爭性抑制c—Jun/ATF2二聚體形成。 3.c—Fos抑制c—Jun/ATF2下游靶基因表達(dá) 為了進(jìn)一步說明c—Fos干擾c—Jun/ATF2二聚體形成，我們觀察神經(jīng)元內(nèi)c—Fos對c—Jun/ATF2下游靶基因的影響。由于神經(jīng)元轉(zhuǎn)染率低，我們構(gòu)建了重組腺病毒Ad—c—Fos和Ad—A—Fos。本實驗室已報道dp5和atf3是c—Jun/ATF2的下游靶基因，通過RT—

12、PCR方法觀察c—Fos和A—Fos是否抑制dp5和atf3的表達(dá)。體外培養(yǎng)第5天的小腦顆粒神經(jīng)元感染腺病毒Ad—GFP或Ad—Fos，MOI=100、滴度為20，000。腺病毒在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)36小時后，換25K、5K模型4小時。收集細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后用特異性引物PCR擴增得到相應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果顯示：Ad—c—Fos、Ad—A—Fos均明顯抑制了dp5和atf3 mRNA水平。 4.c—Fos保護(hù)小腦顆粒神經(jīng)元 前面已

13、證實c—Fos能抑制c—Jun/ATF2二聚體形成及其下游促凋亡靶基因表達(dá)，那么c—Fos是否通過這一機制保護(hù)性干預(yù)保護(hù)神經(jīng)元凋亡呢？為闡明c—Fos是否保護(hù)神經(jīng)元，我們過表達(dá)c—Fos或A—Fos觀察其對神經(jīng)元凋亡影響。在體外培養(yǎng)第5天的小腦顆粒神經(jīng)元，用鈣磷沉淀共轉(zhuǎn)染GFP與pcDNA3.1-Flag—c—Fos或pcDNA3.1-Flag空載體。48小時后，換成25 K、5K模型12小時。加入Hoechst33258(5μg/ml

14、)進(jìn)行活細(xì)胞染色半小時以觀察核形態(tài)，倒置熒光顯微鏡下(300×)觀察并拍照。以GFP陽性細(xì)胞為總數(shù)，計算凋亡率。結(jié)果顯示c—Fos有效的干預(yù)了撤鉀誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。同時我們還過表達(dá)了質(zhì)粒pcDNA3.1-Flag—A—Fos，結(jié)果表明，A—Fos較c—Fos更有效的保護(hù)了神經(jīng)元。 由于神經(jīng)元存在轉(zhuǎn)染率低的局限性，而腺病毒則以其高感染率使其應(yīng)用廣泛而可靠。體外培養(yǎng)第5天的小腦顆粒神經(jīng)元感染腺病毒Ad—GFP或Ad—Fos，MOI=

15、100、滴度為20，000。腺病毒在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)36小時后，換25K、SK模型12小時。加入Hoechst33258(5μg/ml)進(jìn)行活細(xì)胞染色半小時以觀察核形態(tài)，倒置熒光顯微鏡下(300×)觀察并拍照，計算凋亡率。結(jié)果進(jìn)一步肯定了c—Fos及A—Fos保護(hù)神經(jīng)元的這一現(xiàn)象。 結(jié)論： 1.撤鉀誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時，c—Fos表達(dá)下調(diào)。 2.c—Fos干擾c—Jun/ATF2二聚體形成并抑制其下游靶基因。