Humanin對(duì)Aβ-,31-35-引起的大鼠皮層神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimerdisease，AD)是一種常見的以進(jìn)行性記憶減退、認(rèn)知障礙為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，病理改變以大腦皮層和海馬等腦區(qū)的細(xì)胞外老年斑形成、細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)突觸的丟失和神經(jīng)元大量死亡為特征。關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制說(shuō)法各異，但均無(wú)定論，因而缺乏有效的預(yù)防與治療手段。越來(lái)越多的研究表明，β-淀粉樣蛋白(β-amyloidprotein，Aβ)在腦組織中的過(guò)度沉積可能與AD的發(fā)病密切相關(guān)，是A

2、D形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素。20世紀(jì)90年代初，Yankner等首先觀察到較高濃度的Aβ1-42能引起神經(jīng)元死亡；之后的研究又證實(shí)Aβ25～35，一個(gè)小的Aβ片段具有與完整肽鏈相類似的毒性作用，因而認(rèn)為Aβ25～35可能是Aβ發(fā)揮毒性作用的必需結(jié)構(gòu)或活性中心。最近，本實(shí)驗(yàn)室和其他學(xué)者的工作證實(shí)，Aβ31-35一個(gè)更小的肽段，也具有與完整肽鏈和Aβ25～35相似的毒性作用，提示這個(gè)五肽可能是Aβ中更短的關(guān)鍵性序列結(jié)構(gòu)，在Aβ發(fā)揮毒性作用的過(guò)程

3、中具有更重要的意義。Stadelmann等(1998)證實(shí)了AD發(fā)病過(guò)程中神經(jīng)元死亡的主要形式是凋亡，之后的離體實(shí)驗(yàn)證實(shí)Aβ包括Aβ1-42、Aβ25-35及Aβ31-35都可引起神經(jīng)元凋亡，因而探討能抑制Aβ所致的神經(jīng)元凋亡就成為預(yù)防及治療AD的重要途徑。 Humanin(HN)是Hashimoto(2001)報(bào)道的存在于AD患者腦組織中具有神經(jīng)保護(hù)作用的多肽類物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HN能有效抑制多種FAD基因和Aβ衍生物誘發(fā)的神

4、經(jīng)元的死亡，并且證實(shí)HN可抑制Aβ1-42引起的原代培養(yǎng)神經(jīng)元的死亡，但這種抑制機(jī)制未見相關(guān)報(bào)道。由于Aβ31-35與Aβ1-42具有相似的毒性作用，那么HN是否也能抑制Aβ31-35的神經(jīng)毒性以及作用機(jī)制如何?本實(shí)驗(yàn)從以下三方面進(jìn)行觀察和分析：1、觀察HN對(duì)Aβ31-35致神經(jīng)元凋亡的影響；2、對(duì)HN拮抗Aβ31-35致凋亡作用的機(jī)制進(jìn)行研究分析；3、觀察HN對(duì)Aβ31-36引起的神經(jīng)元[Ca2+]i升高的影響。 第一部分H

5、umanin拮抗Aβ31-35致凋亡作用的觀察。文獻(xiàn)報(bào)道，HN能夠抑制Aβ1-42的毒性作用。本實(shí)驗(yàn)室及其他學(xué)者的研究結(jié)果顯示，Aβ31-36與Aβ完整肽鏈具有相似的毒性作用。那么HN是否也能抑制Aβ31-35的毒性作用?本部分采用原代培養(yǎng)的大鼠大腦皮層神經(jīng)元觀察HN對(duì)Aβ31-35致凋亡作用的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：1、HN可以拮抗Aβ31-35致神經(jīng)元凋亡的作用；2、HN拮抗Aβ31-35的致凋亡作用具有劑量和時(shí)間依賴性。只有20μM

6、HN提前16小時(shí)孵育才能抑制Aβ31-35引起的神經(jīng)元凋亡；3、HN對(duì)Aβ31-35引起的神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用主要表現(xiàn)在凋亡發(fā)生的早期。 第二部分Humanin拮抗Aβ31-35致凋亡作用機(jī)制的研究。有文獻(xiàn)報(bào)道Aβ1-42可通過(guò)活化JNK(c-JunN-terminalkinase，c-JunN-末端激酶)途徑，進(jìn)而激活caspase8，經(jīng)外源性途徑引起神經(jīng)元凋亡。前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)顯示HN具有拮抗Aβ31-35致凋亡的作用，

7、那么Aβ31-35是否象Aβ1-42一樣也通過(guò)JNK途徑發(fā)揮致凋亡作用?更重要的是HN是否通過(guò)抑制此途徑而抑制凋亡發(fā)揮保護(hù)作用?我們通過(guò)觀察JNK途徑上的關(guān)鍵基因c-Jun、它的下游基因FasL蛋白的表達(dá)以及檢測(cè)caspase系統(tǒng)(包括caspase8和caspase3)活性的的改變，旨在證實(shí)Aβ31-35和HN是否通過(guò)外源性途徑實(shí)現(xiàn)它們的致凋亡和抗凋亡作用。另外，也通過(guò)檢測(cè)Bax蛋白的表達(dá)、Bax與線粒體的結(jié)合和caspase9活性的

8、改變，分析內(nèi)源性途徑是否也參與了Aβ31-35的致凋亡和HN的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：1、Aβ31-35通過(guò)促進(jìn)c-jun、FasL的表達(dá)經(jīng)外源性途徑引起神經(jīng)元凋亡；2、Aβ31-35通過(guò)促進(jìn)Bax蛋白的表達(dá)并增加Bax與線粒體的結(jié)合經(jīng)內(nèi)源性途徑引起神經(jīng)元凋亡；3、HN通過(guò)抑制Aβ31-35誘導(dǎo)的外源性和內(nèi)源性兩條途徑發(fā)揮其保護(hù)作用，但可能以內(nèi)源性途徑為主。 第三部分Humanin對(duì)抗Aβ31-35引起的培養(yǎng)皮層神經(jīng)元。[C

9、a2+]i升高作用的觀察盡管Aβ的毒性作用機(jī)制尚不明確，但以往的研究認(rèn)為，Aβ的毒性作用可能與其擾亂細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)有關(guān)。神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離[Ca2+]i的異常升高可能是AD時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞死亡的重要因素。既然Aβ的神經(jīng)毒性與細(xì)胞內(nèi)的鈣超載有關(guān)，我們的實(shí)驗(yàn)又已證明HN對(duì)Aβ31-35的神經(jīng)毒性具有抑制作用，那么HN對(duì)Aβ31-35致凋亡作用的保護(hù)作用是否是通過(guò)抑制Aβ31-35所致的細(xì)胞內(nèi)鈣超載而發(fā)揮作用呢?本實(shí)驗(yàn)利用Ca2+熒光成像技術(shù)，觀察了Aβ