Ⅰ組mGluRs介導Aβ-,31-35-神經毒的作用觀察.pdf

1、阿爾茨海默病(AlzheimerDisease，AD)是一種以記憶減退、認知障礙、以及進入癡呆狀態(tài)為特征的腦退行性疾病。其病理改變?yōu)榇竽X皮層和海馬等腦區(qū)出現大量的老年斑(senileplaque,SP)、神經纖維纏結(Neurofibirilarytangle,NFT)以及神經元的大量丟失。β淀粉樣蛋白(β-amyliod，Aβ)是老年斑的主要成份，越來越多的研究表明，Aβ的大量沉積是誘發(fā)AD主要病理改變和臨床表現的關鍵因素之一。研究證

2、實，Aβ以及人工合成的各種Aβ片斷，如Aβ1-42和Aβ25-35，都可誘發(fā)細胞凋亡；近年來，本研究室及其他研究者的工作證實，一個更小的Aβ片段Aβ31-35也具有與完整肽鏈或Aβ25-35類似的神經毒作用，可能是Aβ肽鏈中最短的活性序列。 谷氨酸(Glu)是腦內主要的興奮性遞質,Glu受體可分為離子型谷氨酸受體(inotropicglutamatereceptors，iGluRs)和代謝型谷氨酸受體(metabotropic

3、glutamatereceptors，mGluRs)。前者包括NMDA、AMPA及KA受體等離子通道結構，介導快速興奮性突觸傳遞；后者屬G蛋白耦聯受體家族，根據其氨基酸序列的同源性、信號轉導機制和藥理學特性的不同，將其分為三組：Ⅰ～Ⅲ組mGluRs。其中Ⅰ組包括mGluR1和mGluR5，主要通過活化PLC產生IP3和DG發(fā)揮生物學效應，前者通過引起胞內Ca2+釋放引起細胞內Ca2+升高，后者通過激活PKC發(fā)揮作用。Ca2+升高形成的C

4、a2+信號在胞內可引發(fā)多種生物學效應，而Ca2+超載是病理情況下引起神經損傷的重要機制。因此，Ⅰ組mGluRs的生物學作用尤其是在病理情況下的作用備受關注，而現有報道卻大相徑庭，既有Ⅰ組mGluRs介導神經毒作用的報道，又有他們拮抗神經毒發(fā)揮保護作用的報道。此外，有關Ⅰ組mGluRs對Aβ31-35神經毒作用的影響未見報道。因此，本研究利用培養(yǎng)神經元致凋亡模型[Ca2+]i測定等技術觀察Ⅰ組mGluRs對Aβ31-35致神經元凋亡作用的

5、影響。 研究方法包括利用透射電鏡、AnnexinV-PI雙染流式細胞術(FCM)和TUNEL染色法檢測培養(yǎng)皮層神經元凋亡，利用離子成像法觀察培養(yǎng)皮層神經元[Ca2+]i的變化，利用酶聯免疫法檢測Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9的活性。首先應用Ⅰ組mGluRs激動劑DHPG、特異性mGluR1拮抗劑CPCCOEt和特異性mGluR5拮抗劑MPEP，觀察Ⅰ組mGluRs是否介導了Aβ31-35對原代培養(yǎng)皮

6、層神經元的致凋亡作用，檢測Aβ31-35誘導的細胞凋亡是否伴有鈣超載，并通過測定凋亡過程caspase系統活性的改變，分析Aβ致凋亡和有關的拮抗劑，激動劑作用是否通過凋亡的外源性或內源性途徑實現；并且應用PKC抑制劑BMI觀察Ⅰ組mGluRs介導Aβ31-35的作用是否通過PKC信號通路。從而闡明Ⅰ組mGluRs在Aβ31-35致原代培養(yǎng)神經元毒性過程的作用，為深入了解Ⅰ組mGluRs的生物學作用及Aβ31-35的神經毒作用提供進一步的

7、實驗依據。 第一部分Ⅰ組mGluRs介導Aβ31-35誘導神經元凋亡的作用觀察。本部分實驗在Aβ31-35引起小鼠皮層神經元凋亡的基礎上，觀察Ⅰ組mGluRs激動劑DHPG和特異性mGluR1拮抗劑CPCCOEt和mGluR5拮抗劑MPEP對Aβ31-35致凋亡作用的影響。 第二部分Ⅰ組mGluRs對Aβ31-35誘導的神經元[Ca2+]i變化的作用觀察。研究證實，[Ca2+]i升高在各種原因所致的細胞損傷包括細胞凋

8、亡中發(fā)揮非常重要的作用。本實驗室以往的觀察及本研究前期的實驗均證實，Aβ31-35可引起神經元凋亡，同時第一部分實驗又證實Ⅰ組mGluRs介導了Aβ31-35的致凋亡作用。為證實Aβ31-35對培養(yǎng)皮層神經元[Ca2+]i的作用以及Ⅰ組mGluRs對Aβ31-35誘導的[Ca2+]i變化的影響，我們利用生后1天的大鼠原代培養(yǎng)皮層神經元，以Ca2+指示劑Fura-2作為[Ca2+]i的熒光探針，利用離子成像技術在培養(yǎng)的皮層神經元進行觀察。

9、并通過計算F340/F380值，定量反映[Ca2+]i變化的幅度和動態(tài)變化過程，以期證實：1)Aβ31-35對培養(yǎng)皮層神經元[Ca2+]i的作用；2)Ⅰ組mGluRs激活對培養(yǎng)皮層神經元[Ca2+]i的作用及機制探討；3)Ⅰ組mGluRs激活對Aβ31-35所致皮層培養(yǎng)神經元[Ca2+]i變化的影響。 第三部分Ⅰ組mGluRs介導Aβ31-35誘導神經元凋亡的作用機制探討。前兩部分的研究結果顯示，Aβ31-35可致培養(yǎng)皮層神經

10、元凋亡及[Ca2+]i升高，同時證實利用DHPG激活Ⅰ組mGluRs可致神經元凋亡及[Ca2+]i升高，此外DHPG還具有增強Aβ31-35致神經元凋亡和升高[Ca2+]i的作用。又由于Ⅰ組mGluRs既可通過IP3引起Ca2+釋放也可通過DG激活PKC發(fā)揮作用。因此，為探討Ⅰ組mGluRs介導Aβ31-35神經毒性作用的機制，我們利用生后1天的大鼠原代培養(yǎng)皮層神經元，用AnnexinV-PI雙染流式細胞術觀察PKC抑制劑BMI對Ⅰ組m