DBDCT初步毒代動力學(xué)、神經(jīng)毒性作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：二-（4-氯苯甲酰異羥肟酸）二正丁基合錫（DBDCT）是一種典型的R2SnL2型有機(jī)錫類化合物，大量資料表明，此類有機(jī)錫化合物可致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，但具體機(jī)制不明，有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)第一部分?jǐn)M建立生物樣品中錫含量的檢測方法，確定DBDCT毒代動力學(xué)參數(shù)，確定大鼠暴露于毒劑量DBDCT的組織分布，并證明DBDCT可以透過血腦屏障，從而對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響；第二部分及第三部分?jǐn)M通過動物在體實(shí)驗(yàn)和神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)兩條途徑研究DBDCT

2、引起神經(jīng)毒性的作用，并對可能機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　方法：（1）建立原子熒光光譜法（AFS）檢測血漿及組織勻漿中錫含量的方法，并采用AFS測定大鼠單次毒劑量（15mg/kg）靜脈注射DBDCT后的毒代動力學(xué)參數(shù)及組織分布，初步判斷DBDCT是否可以通過血腦屏障產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)影響；（2）采用紫外分光光度法測定大鼠多次靜脈注射DBDCT后的血清及腦組織生化指標(biāo)；（3）觀察大鼠多次靜脈注射DBDCT前后體重的變化，并用HE染色檢測主要組織

3、臟器的病理學(xué)改變，確定主要毒性靶器官和毒性產(chǎn)生的可能原因；（4）通過TUNEL和Westernblot技術(shù)，研究大鼠多次靜脈注射DBDCT后腦組織凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，初步明確DBDCT產(chǎn)生神經(jīng)毒性的機(jī)制；（5）以PC12細(xì)胞為體外神經(jīng)毒性研究對象，采用MTT法測定染毒后細(xì)胞的增殖抑制率，通過光鏡、熒光染色和電鏡等方法觀察細(xì)胞核形態(tài)的變化，以PI/AnnexinV-FITC雙染檢測細(xì)胞染毒后的凋亡率，DNALadder方法檢測細(xì)

4、胞染毒后凋亡的特異性條帶，用RT-PCR法檢測凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況，從而證實(shí)DBDCT通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生神經(jīng)毒性；（6）采用紫外分光光度法測定PC12細(xì)胞染毒前后caspase-3和caspase-9活性的變化；以流式細(xì)胞術(shù)測定線粒體跨膜電位（ΔΨm）及活性氧（ROS）的變化，通過Westernblot分析Bax、Bcl-2、Cyt-c、caspase-3、caspase-9、p-JNK及p-p38等蛋白表達(dá)，進(jìn)一步確證DBDCT通

5、過多個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)凋亡，產(chǎn)生神經(jīng)毒性。
　　結(jié)果：（1）建立了定量準(zhǔn)確，精密度高，操作方便的檢測血漿及組織勻漿中錫含量的AFS；測定了大鼠單次毒劑量靜脈注射DBDCT后毒代動力學(xué)參數(shù)：分布半衰期t1/2α為49.977min、消除半衰期t1/2β為1.260min、表觀分布容積Vc為8.201(μg/mL)/(mg/kg)、曲線下面積AUC為56.073(mg/kg)min、清除率Cl為0.297μg/mL/min/(mg/k

6、g)；大鼠單次毒劑量靜脈注射后DBDCT可迅速分布到各組織，但錫濃度維持時(shí)間較短，腎上腺中錫濃度最高，其余組織中錫濃度相似，腦組織中能檢測到少量錫元素，注射后兩小時(shí)內(nèi)維持0.10μg/g以上水平；（2）大鼠多次靜脈注射DBDCT后，血清中AST、ALT、ALP、GGT、STB、BUN及CRE均顯著升高（p<0.01），腦組織中SOD及GSH-Px顯著降低（p<0.01），而MDA顯著增高（p<0.01）；（3）大鼠多次靜脈注射DBDCT

7、后，前三周體重雖有增加，但增長緩慢，最后一周稱重時(shí)體重不增反降，HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，染毒組動物肝臟均被膜增厚，部分出現(xiàn)肝細(xì)胞嗜酸性變，核固縮等病理改變，部分腦組織也出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)節(jié)狀增生及皮質(zhì)部分神經(jīng)細(xì)胞變性等病理改變；（4）大鼠多次靜脈注射DBDCT后對腦組織進(jìn)行TUNEL染色，光學(xué)顯微鏡下可見染毒組大鼠大腦皮質(zhì)中的細(xì)胞核大量呈現(xiàn)圓形和不規(guī)則形，棕染且著色深，凋亡指數(shù)AI極顯著增高，從8.26±1.25％增加到30.3±1

8、.94%（p<0.01），Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示染毒組蛋白Bax表達(dá)增加，蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著減少，Bax/Bcl-2比值從0.767上升至2.842，且蛋白caspase-3及caspase-9均出現(xiàn)顯著地剪切條帶；（5）MTT法測定DBDCT暴露24h后PC12細(xì)胞IC50值為4.110μmol/L，通過光鏡、熒光染色和電鏡觀察到DBDCT染毒后PC12細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡細(xì)胞所特有的形態(tài)學(xué)特征，PI/AnnexinV-FI

9、TC雙染顯示隨DBDCT染毒劑量的增大和暴露時(shí)間的延長，PC12細(xì)胞的凋亡率顯著增加（p<0.05），瓊脂糖凝膠電泳中可見凋亡特征性改變的DNA梯形帶，RT-PCR實(shí)驗(yàn)可見凋亡相關(guān)基因caspase-3、caspase-8、caspase-9、NF-κB、Fas、Fas-L及Cty-c的表達(dá)均發(fā)生顯著變化（p<0.05，p<0.01）；（6）PC12細(xì)胞暴露于不同染毒劑量DBDCT不同時(shí)間后，caspase-3和caspase-9的活性

10、顯著增加（p<0.05，p<0.01），隨著DBDCT染毒劑量的增加和暴露時(shí)間的延長，△Ψm顯著下降，ROS的生成明顯增多，蛋白Bcl-2的表達(dá)下凋，蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，線粒體內(nèi)蛋白Cyt-c含量顯著下降，胞質(zhì)中蛋白Cyt-c含量明顯增加，蛋白caspase-3及caspase-9均出現(xiàn)越來越顯著地剪切條帶，p-JNK和p-p38的表達(dá)逐漸增加，且均有明顯量效和時(shí)效關(guān)系（p<0.01）。
　　結(jié)論：（1）AFS適用于測定血液及組織

11、樣品中錫的含量，大鼠單次靜脈注射DBDCT后血中錫濃度隨時(shí)間變化符合二室模型，分布迅速，錫濃度維持時(shí)間較短，在主要組織器官中不易蓄積，DBDCT可以透過血腦屏障，因此可能對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響；（2）DBDCT影響大鼠體重增長和一般生長發(fā)育，改變大鼠血清中多種生化指標(biāo)，表現(xiàn)出顯著地肝臟及腎臟毒性；（3）DBDCT降低大鼠腦組織中抗氧化系統(tǒng)的活性，增強(qiáng)腦組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，一定程度上通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對大鼠腦組織神經(jīng)系統(tǒng)造成損害；（4）DBDC