生物樣品中MCC-555定量分析及臨床前藥代動力學(xué)與毒代動力學(xué)研究.pdf

1、本文采用以蛋白沉淀法提取血槳樣品，液液萃取法提取組織和排泄樣品，建立了以反相高效液相色譜法測定生物樣品中MCC-555的濃度，生物樣品的內(nèi)源性物質(zhì)及代謝物均不干擾樣品的測定，經(jīng)方法認(rèn)證，各自的生物樣品中MCC-555線性、精密度和準(zhǔn)確度符合生物樣品測定要求。將此方法應(yīng)用到MCC-555臨床前藥代動力學(xué)和毒代動力學(xué)研究中，考察了MCC-555的吸收、分布、代謝、排泄過程和血漿蛋白結(jié)合率，初步研究了MCC-555的體內(nèi)外代謝，推測主要代謝產(chǎn)

2、物和代謝途徑，并結(jié)合MCC-555長期毒性試驗中病理組織學(xué)研究，為MCC-555的臨床研究提供依據(jù)。 MCC-555為首次合成的新的胰島素增敏劑，藥理實驗證明其有很強(qiáng)的抗糖尿病活性作用，目前正申報一類新藥。本文的工作旨在對其臨床前藥代動力學(xué)和毒代動力學(xué)作一整體評價，以支持人體藥代動力學(xué)研究并為臨床用藥提供參考依據(jù)。 一、生物樣品中MCC-555分析方法的建立本文分別采用蛋白沉淀法處理血漿樣品和液液萃取法處理組織和排泄樣品

3、兩種生物樣品預(yù)處理，建立了以MCC-555中間體(化學(xué)名為5-[[6-(2-氟苯甲基)-氧-2-萘環(huán)]亞甲基]-2，4-噻唑烷二酮)為內(nèi)標(biāo)的反相高效液相色譜分離—熒光光譜檢測MCC-555體內(nèi)分析方法。色譜分離條件為：色譜柱：KomasilC18(5μg，250×4.6mm)；流動相組成為乙腈、水及用來調(diào)節(jié)pH值的磷酸二氫鈉(pH4.5)，流速1.0ml/min；熒外激發(fā)波長為232nm，熒外發(fā)射波長為352nm，柱溫35±1℃。采用本

4、文建立的生物樣品預(yù)處理方法和反相高效液相色譜法分離測定生物樣品中MCC-555的含量，生物樣品預(yù)處理方法回收率高，色譜分離選擇性好。本法的準(zhǔn)確度、精密度、靈敏度、專屬性和定量線性范圍均達(dá)到體內(nèi)藥物分析的要求。該方法成功用于MCC-555的臨床前藥代動力學(xué)和毒代動力學(xué)研究。 二、MCC-555在動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究SD大鼠單次口服給藥(2.5、5和10mg/kg)和比格犬單次口服給藥(2.5、5和10mg/kg)后于不同時間點

5、取血，用上述建立的HPLC法測定血漿中MCC-555的濃度，根據(jù)所得的血漿藥物濃度—時間曲線，采用非房室模型推算藥物動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，SD大鼠單劑量口服給藥MCC-555原料藥后體內(nèi)血藥濃度消除較慢，個體差異較大。經(jīng)非房室模型法估算的SD大鼠單劑量口服給藥MCC-555原料藥2.5、5和10mg/kg三個劑量組后達(dá)峰時間(Tmax)均為3.0h；達(dá)峰濃度(Cmax)分別為2.213、3.348、7.267μg/mL。藥時曲線末端相消

6、除半衰期(t1/2)分別為12.6、14.5、14.7h。三個劑量組的AUC0～8分別為18.217、29.641和67.325μg·h/mL，AUC與給藥劑量基本呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為0.988。 6條成年、健康比格犬口服給藥MCC-555原料藥后體內(nèi)血藥濃度消除較慢，個體差異較大。經(jīng)非房室模型法估算的6條成年、健康比格犬單劑量口服給藥MCC-555原料藥2.5、5和10mg/kg三個劑量組后達(dá)峰時間(Tmax)為3.83±0

7、.41、3.83±0.41、3.67±0.52h；達(dá)峰濃度(Cmax)為1.392±0.257、3.882±1.223、6.458±0.776μg/mL。藥時曲線末端相消除半衰期(t1/2)分別為12.50±1.52、14.50±1.03、16.41±4.91h。三個劑量組的AUC0～8分別為16.45±4.00、34.93±10.06和55.91±25.94μg·h/mL，AUC與給藥劑量基本呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為0.977。

8、 三、MCC-555在大鼠體內(nèi)的組織分布研究SD大鼠口服給藥MCC-5555mg/kg后，于給藥后0.5、1.5、3.0、4.0、8.0、12.0和24.0h眼眶取血后處死，立即取出血液及各臟器組織，用濾紙吸干浮血，稱重后用甲醇制成勻漿，取勻漿處理，用HPLC法測定各組織藥物濃度。結(jié)果顯示，給藥后MCC-555分布于主要組織，各臟器組織中的藥物含量均低于血漿，其中心、肝、脾、肺和腎藥物濃度最高，卵巢、睪丸、小腸和胃次之，腦、肌肉、脂肪和

9、子宮組織最少。 四、MCC-555在大鼠體內(nèi)的排泄研究SD大鼠口服給藥MCC-5555mg/kg后收集膽汁、尿液和糞便樣品，記錄體積和重量，用HPLC方法分析樣品中MCC-555的濃度。將膽汁、尿液及糞便中的藥物濃度乘以相應(yīng)的排泄膽汁量、尿量或糞便量，并累加求和，計算藥物的累積排泄量。結(jié)果顯示大鼠單次灌胃給藥后從膽汁、尿液和糞便中原型藥物的累積排泄量是2.18％、0.23％和1.17％。 五、MCC-555的血漿蛋白結(jié)合

10、率研究血漿中加入MCC-555使最終的濃度達(dá)到0.2，2.0和10.0μg/mL，每份加藥血漿樣品用平衡透析法在4℃條件下透析72h，透析結(jié)束后，用HPLC法分別測定血漿及緩沖液樣品中的藥物濃度，計算藥物的血漿蛋白結(jié)合率，結(jié)果表明在上述范圍內(nèi)MCC-555與人的血漿蛋白結(jié)合率＞90％，無濃度依賴性，該結(jié)果與同類化合物的血漿蛋白結(jié)合率相似。 六、MCC-555在動物體內(nèi)的毒代動力學(xué)研究本試驗設(shè)計成年、健康比格犬單劑量口服給藥MCC

11、-555原料藥6.67、20、40mg/kg三個劑量組進(jìn)行毒代動力學(xué)研究。選擇12條比格犬，雌雄各半，按體重隨機(jī)分成3組：低、中、高劑量組，其給藥劑量分別為6.67、20和40mg/kg。每組一周給藥6次(每天給藥1次)，第七天停藥，給藥周期為九個月。每次給藥分別灌胃6.67、20和40mg/kg三個劑量組的MCC-555原料藥(用0.5％CMC-Na溶液混懸，給藥容量為1ml/kg)。于給藥前及給藥后第1，30，90，180，270天

12、取血，每次取血點分別為給藥后0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、24.0小時。用上述建立的HPLC-熒光法測定血漿中MCC-555的濃度，根據(jù)所得的血漿藥物濃度—時間曲線，采用非房室模型推算藥物動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示12條成年、健康比格犬單劑量多劑量口服給藥MCC-555原料藥后，MCC-555在比格犬體內(nèi)并無蓄積。 在第270天24.0h取血點取完血后，將12條比格犬處死，迅速取其心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、腦、肌

13、肉、脂肪、睪丸、子宮、卵巢，用濾紙吸干表面的浮血，至于-20℃冰箱保存待用。按組織樣品預(yù)處理操作，測得實驗數(shù)據(jù)，其中心、肝、腦和睪丸數(shù)據(jù)代入肝組織樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得含量，肺、脾和腎數(shù)據(jù)代入肺組織樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得含量，胃、小腸、肌肉、卵巢、子宮數(shù)據(jù)代入小腸組織樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得含量。MCC-555在比格犬體內(nèi)的組織分布研究結(jié)果表明，各臟器組織中的藥物含量均明顯低于血漿，在主要臟器沒有蓄積，其中肝、腎、睪丸、肺、脾藥物濃度最高，胃、腸、腦

14、、子宮次之，其余心、肌肉、卵巢、脂肪組織最少。 MCC-555在比格犬長期毒性試驗中病理組織學(xué)研究表明，在長期毒性條件下，心，肝，脾，肺，腎，腦，氣管，食管，膀胱，腎上腺，垂體及性器官等器官或組織，沒有發(fā)現(xiàn)有明顯的器質(zhì)性病變。MCC-555對比格犬的毒性作用的靶器官為胃腸道，膽囊，其毒性作用是可逆的。MCC-555對比格犬的毒性劑量為40mg/kg，安全劑量為20mg/kg。 七、MCC-555在動物體內(nèi)外代謝產(chǎn)物的初步