鉀通道介導(dǎo)Aβ的神經(jīng)毒及HN的拮抗作用：電生理和凋亡的實(shí)驗(yàn)觀察.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease，AD)，又稱老年癡呆，是以記憶、認(rèn)知功能受損為主要特征的神經(jīng)退行性疾病，其典型的病理學(xué)特征為老年斑(senileplaque，SP)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillarytangle，NFT)和大量的神經(jīng)元喪失。β—淀粉樣蛋白(β—amyloidprotein，Aβ)是老年斑的主要成分，由39～43個(gè)氨基酸組成。有關(guān)Aβ1-40和Aβ1-42完整肽鏈的神經(jīng)毒作用已有廣泛的報(bào)道。

2、研究發(fā)現(xiàn)Aβ25-35，一個(gè)短的分子片斷，具有與Aβ完整肽鏈相同的神經(jīng)毒作用，因此被廣泛應(yīng)用于AD的實(shí)驗(yàn)研究。由于Aβ被普遍認(rèn)為是AD的關(guān)鍵性致病因素，在AD發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，因而深入研究其毒性作用機(jī)制，從而抑制其毒性將是防治AD的重要環(huán)節(jié)。 有關(guān)Aβ的毒性機(jī)制眾說(shuō)紛紜，近來(lái)研究表明，Aβ通過(guò)擾亂細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)，影響膜電生理特性而發(fā)揮重要作用。大量研究證實(shí)，鉀離子通道的功能紊亂在AD的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。鉀離子通道能夠

3、影響胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞容積，并通過(guò)調(diào)節(jié)膜電位調(diào)控遞質(zhì)釋放、激素分泌等生理功能。在幾乎所有興奮性細(xì)胞和絕大多數(shù)非興奮性細(xì)胞靜息膜電位的維持過(guò)程中鉀通道發(fā)揮主要作用，同時(shí)還可影響動(dòng)作電位的頻率和時(shí)程，由此調(diào)控細(xì)胞的興奮性以及參與Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。此外，研究表明，鉀通道在學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮重要作用，鉀通道與Cp20(一種分子量為20kDa的GTP結(jié)合蛋白)、胞內(nèi)鈣離子、蛋白激酶C(PKC)共同參與學(xué)習(xí)和記憶的過(guò)程。病理?xiàng)l件下，如發(fā)生AD時(shí)中樞神

4、經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中均存在鉀通道功能異常。近來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)，鉀通道除影響膜電生理特性、興奮性和鈣穩(wěn)態(tài)及一些生理及病理過(guò)程，還參與神經(jīng)元凋亡的誘導(dǎo)，促進(jìn)凋亡發(fā)生。 蛋白激酶C(PKC)作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)物質(zhì)，參與許多生理功能的調(diào)節(jié)。在對(duì)鉀通道的調(diào)節(jié)過(guò)程中，PKC尤為重要。研究顯示，PKC激活可使鉀電流抑制。而且有證據(jù)顯示，Aβ的毒性作用與PKC密切相關(guān)。本研究室以往的研究也證實(shí)PKC介導(dǎo)了Aβ31-35引起的海馬長(zhǎng)持續(xù)—長(zhǎng)時(shí)程(L—

5、LTP)壓抑。那么，PKC是否也參與了Aβ所致的鉀通道功能的異常改變呢?此外，本室及其他的研究者以往的工作表明，Aβ能引起神經(jīng)元細(xì)胞活力降低、促進(jìn)凋亡發(fā)生，那么鉀通道是否也參與Aβ引起的細(xì)胞凋亡過(guò)程? 基于上述的研究背景，為進(jìn)一步明確Aβ對(duì)鉀通道功能的影響及鉀通道功能異常產(chǎn)生的毒性作用；為明確HN拮抗Aβ神經(jīng)毒的電生理(鉀通道)機(jī)制；明確PKC在Aβ引起鉀通道功能異常時(shí)的作用及HN的拮抗作用；明確鉀通道在Aβ所致凋亡中的作用以及

6、HN的神經(jīng)保護(hù)作用，本研究設(shè)計(jì)了以下三部分實(shí)驗(yàn)： 第一部分：Aβ25-35介導(dǎo)的鈣非依賴性鉀電流的抑制及HN的拮抗作用。 為了深入理解Aβ的神經(jīng)毒作用的離子機(jī)制及探討HN發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的電生理機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察Aβ25-35對(duì)急性分離的海馬神經(jīng)元鈣非依賴性的鉀電流(包括快速失活鉀電流(fasttransientcurrent，IA)和延遲整流鉀電流(delayedrectifier—likecurre

7、nt，IK))的影響以及HN的拮抗作用。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，采用三種不同的給藥順序進(jìn)行觀察，即在灌流Aβ之前、同時(shí)或之后給予同等濃度的HN。在全細(xì)胞電壓鉗記錄的條件下，給予細(xì)胞由-40～+70mV(階躍10mV)的去極化脈沖，分別記錄鈣非依賴性的總的鉀電流和IK電流，再經(jīng)公式換算得出IA。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，IK取其158ms處的穩(wěn)態(tài)電流，而IA取其峰值電流進(jìn)行分析。在同一海馬神經(jīng)元上，比較HN不同的給藥方式對(duì)Aβ引起的鉀電流作用的影響。 結(jié)果

8、表明： (1)急性給予Aβ25-35可使分離神經(jīng)元的鈣非依賴性的總的鉀電流包括IK、IA抑制，這種作用可能通過(guò)提高興奮性影響鈣穩(wěn)態(tài)，如形成鈣超載而發(fā)揮毒性作用； (2)HN拮抗Aβ25-35介導(dǎo)的對(duì)鈣非依賴性鉀電流的抑制以及胞內(nèi)鈣升高； (3)電壓依賴性鉀通道可能是HN拮抗Aβ發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的靶點(diǎn)之一； (4)結(jié)合以往實(shí)驗(yàn)和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，HN和Aβ可能作用于細(xì)胞膜同一靶點(diǎn)而發(fā)揮作用，HN比Aβ可能更具有親和力

9、。 第二部分：PKC介導(dǎo)的Aβ25-35對(duì)鉀通道的抑制及HN的拮抗作用。 鑒于PKC在鉀通道調(diào)節(jié)過(guò)程中的重要作用，即PKC激活可抑制鉀電流以及廣泛報(bào)道的PKC介導(dǎo)Aβ的毒性作用。在第一部分研究結(jié)果的基礎(chǔ)上(Aβ抑制鈣非依賴性鉀電流)，通過(guò)使用PKC的激動(dòng)劑PDBu和阻斷劑chelerythrine，應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察PKC是否介導(dǎo)了Aβ對(duì)鈣非依賴性鉀電流的抑制和HN的拮抗作用。同時(shí)，采用蛋白免疫印跡技術(shù)進(jìn)一步觀察A

10、β對(duì)PKC的活化以及HN的拮抗作用。 結(jié)果表明： (1)PKC激動(dòng)劑劑量依賴性的抑制IK，即激活PKC模擬了Aβ對(duì)鉀通道的作用； (2)Aβ能夠活化(磷酸化)神經(jīng)元PKC，活化的PKC介導(dǎo)了對(duì)鉀通道的抑制，而PKC阻斷劑拮抗Aβ引起的IK電流的抑制； (3)HN抑制Aβ誘導(dǎo)的PKC的活化(磷酸化)； (4)HN拮抗PKC介導(dǎo)的Aβ對(duì)IK的抑制。 綜上，Aβ通過(guò)活化PKC介導(dǎo)其對(duì)鉀通道的作用

11、，這可能是Aβ毒性作用的重要機(jī)制之一，抑制Aβ對(duì)PKC的活化及抑制PKC介導(dǎo)的毒性作用可能是HN拮抗Aβ神經(jīng)毒的機(jī)制之一。 第三部分：鉀通道開(kāi)放介導(dǎo)的Aβ25-35致凋亡及HN的拮抗作用。 前一部分的實(shí)驗(yàn)及其他一些電生理實(shí)驗(yàn)觀察顯示，Aβ能夠抑制鉀通道開(kāi)放及鉀電流，使膜電位負(fù)值變小，由此導(dǎo)致膜容易去極化，動(dòng)作電位的時(shí)程和有效不應(yīng)期延長(zhǎng)，胞內(nèi)鈣內(nèi)流增多，繼發(fā)鈣超載，從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性。新近的文獻(xiàn)報(bào)道，鉀通道開(kāi)放增加、鉀外流增

12、多亦可產(chǎn)生毒性作用，但不是影響興奮性和鈣信號(hào)而是誘導(dǎo)凋亡。在培養(yǎng)的神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)慢性孵育Aβ通過(guò)引起鉀通道開(kāi)放增加，大量鉀外流誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。上述Aβ對(duì)鉀通道的不同作用(通道抑制，鉀電流減少或通道開(kāi)放，鉀外流增加)是在不同的實(shí)驗(yàn)條件下觀察的結(jié)果，前者是在電生理記錄條件下通過(guò)急性給藥觀察的結(jié)果，后者是在細(xì)胞培養(yǎng)條件下慢性孵育藥物觀察的結(jié)果。在完成了電生理?xiàng)l件下進(jìn)行的Aβ對(duì)鉀通道功能影響的觀察后，設(shè)計(jì)了本部分實(shí)驗(yàn)，即使用原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元，觀察

13、鉀通道在Aβ引起的神經(jīng)元凋亡中的作用及HN的拮抗作用。 實(shí)驗(yàn)中采用鉀通道的阻斷劑，包括對(duì)IK敏感的TEA和其同源類似物TPeA以及對(duì)IA敏感的4—AP以及使用高濃度的KCl提高細(xì)胞外鉀離子濃度來(lái)抑制鉀離子外流，觀察阻止鉀離子過(guò)渡外流能否拮抗Aβ引起的神經(jīng)元死亡；同時(shí)應(yīng)用鉀離子的載體valinomycin(相當(dāng)于開(kāi)放劑)誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡(這是目前研究鉀外流增多引起凋亡的通用模型)，在此基礎(chǔ)上觀察HN對(duì)鉀外流增多引起凋亡的拮抗作用，明

14、確HN拮抗Aβ引起神經(jīng)元死亡的可能機(jī)制。實(shí)驗(yàn)過(guò)程采用原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元，通過(guò)細(xì)胞毒性檢測(cè)方法(cck-8試劑盒，乳酸脫氫酶試劑盒，Calcein—AM染色)和凋亡檢測(cè)方法(流式細(xì)胞術(shù)，caspase-3試劑盒，TUNEL染色)分析鉀通道在Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用。 結(jié)果表明： (1)在離體神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的條件下，Aβ導(dǎo)致培養(yǎng)神經(jīng)元產(chǎn)生凋亡； (2)Aβ引起的神經(jīng)元凋亡與慢性孵育Aβ引起鉀通道開(kāi)放導(dǎo)致鉀離子大量外

15、流有關(guān)； (3)HN可拮抗鉀通道開(kāi)放誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。綜上，HN可通過(guò)拮抗鉀通道開(kāi)放抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，這可能是HN拮抗Aβ致凋亡作用的機(jī)制之一。 綜上結(jié)果，可得出如下結(jié)論： (1)急性給予Aβ25-35可使分離的神經(jīng)元鈣非依賴的鉀通道(鉀電流)抑制，包括IA和IK，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高；HN可拮抗由Aβ25-35誘導(dǎo)的鈣非依賴性的鉀電流的抑制以及胞內(nèi)鈣升高； (2)Aβ25-35可能通過(guò)

16、活化PKC系統(tǒng)介導(dǎo)對(duì)鉀電流的抑制； (3)HN通過(guò)拮抗Aβ25-35誘導(dǎo)的PKC活化(磷酸化)從而拮抗Aβ25-35誘導(dǎo)的對(duì)鉀電流的抑制； (4)慢性孵育Aβ25-35導(dǎo)致培養(yǎng)的神經(jīng)元凋亡，鉀通道的大量開(kāi)放可能是介導(dǎo)Aβ25-35致凋亡的機(jī)制之一； (5)HN可通過(guò)拮抗鉀通道開(kāi)放抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，這可能是HN拮抗Aβ致凋亡作用的機(jī)制之一； (6)鉀通道功能異常無(wú)論是開(kāi)放抑制(鉀電流減小)或開(kāi)放增加

17、(鉀外流增加)均可造成毒性作用，前者通過(guò)提高神經(jīng)興奮性或引起胞內(nèi)鈣超載而產(chǎn)生毒性作用，而后者則通過(guò)誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮毒性作用； (7)不同的實(shí)驗(yàn)條件及給藥方式可能通過(guò)不同的機(jī)制使Aβ產(chǎn)生對(duì)鉀通道的不同效應(yīng)。電生理記錄過(guò)程的急性給藥使通道抑制，鉀電流減小；而細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的慢性孵育可使通道開(kāi)放增加，鉀外流增加。急性給藥產(chǎn)生的鉀通道抑制可能是Aβ對(duì)膜通道及膜電流產(chǎn)生的直接效應(yīng)，而慢性孵育可能是由于上調(diào)了鉀通道蛋白表達(dá)，使其數(shù)量增加，開(kāi)放增加