一、β淀粉樣蛋白31-35片段對海馬CA1神經(jīng)元BK通道和[Ca2+]i的影響：全細胞膜片鉗和離子熒光成像技術(shù)觀察;二、Humanin對Aβ31-35抑制大鼠海馬神經(jīng)元BK電流及升高[Ca2+]i作用的觀察;三、Ⅰ型代謝型谷氨酸受體參與脊髓痛信號傳遞作用.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分：β淀粉樣蛋白31-35片段對海馬CAl神經(jīng)元BK通道和[Ca<'2+>]<,i>的影響：全細胞膜片鉗和離子熒光成像技術(shù)觀察 阿爾采末病(Alzheimer's disease，AD)是一種不可逆的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病。主要臨床表現(xiàn)為進行性學習、記憶和認知能力的減退；主要病理特征為新皮層、海馬出現(xiàn)高密度老年斑(SP)，神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)和大量神經(jīng)元的丟失等。β淀粉樣蛋白(amyloi

2、dβ-protein，Aβ)是構(gòu)成老年斑的重要成分。 關(guān)于Aβ及其片段的神經(jīng)毒作用的機制仍未徹底明了。已有研究報道，它們除了能引起Ca<'2+>超載、氧化應(yīng)激等毒性作用外，對細胞膜上離子通道活動的影響引起了人們的廣泛興趣。 本研究擬采用全細胞膜片鉗記錄技術(shù)，在急性分離的大鼠海馬CA1神經(jīng)元上觀察Aβ31-35對全細胞BK電流的影響；并采用Ca<'2+>熒光成像技術(shù)(Ca<'2+>nuorescence imaging)，

3、觀察Aβ31-35對海馬神經(jīng)元的[Ca<'2+>]<,i>的影響，以期對Aβ31-35神經(jīng)毒性作用作更深入的探討。 膜片鉗及胞內(nèi)鈣濃度測定結(jié)果顯示，1)利用全細胞膜片鉗記錄技術(shù)結(jié)合通道阻斷劑及無Ca<'2+>液灌流后可記錄到神經(jīng)元的BK電流(瞬變外向電流)；2)Aβ31-35可通過抑制BK通道而降低BK電流；3)Aβ31-35可引起海馬CA1神經(jīng)元的[Ca<'2+>]<,i>升高而引發(fā)鈣超載；4)由于5μM的Aβ31-35 R抑

4、制BK電流而不影響[Ca<'2+>]<,i>，推測Aβ31-35對海馬神經(jīng)元[Ca<'2+>]<,i>及BK通道的影響可能是通過不同的途徑發(fā)揮作用。 第二部：分Humanin對Ap31—35抑制大鼠海馬神經(jīng)元BK電流及升高[C8<'2+<]<,i>作用的觀察 Humanin(HN)是新近發(fā)現(xiàn)的由24個氨基酸組成的線性多肽，能有效抑制由多種FAD基因突變和A β衍生物誘發(fā)的神經(jīng)毒作用，如抑制由A β1-42和A β 25-

5、35引起的大腦皮層培養(yǎng)神經(jīng)元死亡等。本實驗擬采用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄大電導(dǎo)Ca<'2+>激活K<'+>通道(BK)電流及電壓門控Ca<'2+>電流，以及利用激光共聚焦技術(shù)，觀察HN對A β 31-35抑制大鼠海馬神經(jīng)元BK電流及升高[Ca<'2+>]<,i>作用的影響，并對HN神經(jīng)保護作用的機制進行進一步探討。 結(jié)果顯示：在只含有A β 31-35的灌流液中記錄到的BK電流的最大峰值由對照的3303.67±332.7pA減少為2

6、715.12±82.99pA，減少率為17.3％±6.8％(P<0.005，n=5);在此基礎(chǔ)上加入HN進行記錄時發(fā)現(xiàn)，記錄到的BK電流最大峰值進一步減少為2225.54±254.29pA，較單獨使用A β 31-35時BK電流幅度更低，與對照組相比，減少率為32.7％±2.0％(P<0.001)，與單獨使用Aβ 31-35相比，減少率為18.2％±7.7％(P<0.005)。 鑒于上述出乎意料的結(jié)果，觀察了單獨應(yīng)用HN對海馬C

7、A1神經(jīng)元BK電流的作用。在0mV的膜電位時，BK電流的峰值從對照組的1405.97±350.87pA減少為加入HN(5 μ M)后的999.74±247.72pA，減少率為28.4％±10.4％(P<0.05，n=7)。 HN對海馬CA1神經(jīng)元電壓門控Ca<'2+>通道的作用。 利用全細胞膜片鉗技術(shù)，觀察了HN對海馬CA1神經(jīng)元的電壓門控Ca<'2+>通道的作用。在全細胞電壓鉗記錄的條件下，給予細胞由-60～+50 m

8、V(以10 mV遞增)的階躍去極化刺激，可記錄到快速的內(nèi)向電流(浸浴液中含有TTX阻斷Na<'+>通道)，最大峰值出現(xiàn)在0 mV。浸浴液中加入HN(5 μ M)后，Ca<'2+>電流的峰值(0mV膜電位)由-622.3±118.13 pA減少為-467.4±112.28 pA，減少率為25.2％±6.9％，兩者具有顯著性差異(P<0.05，n=7)。 綜上所述，可得出如下結(jié)論：1)A β具有升高[Ca<'2+>]；和抑制BK電流

9、的作用；2)A β誘發(fā)的Ca<'2+>超載是Aβ產(chǎn)生細胞毒作用的重要原因；3)HN通過抑制L-型鈣通道而減弱A β誘發(fā)的Ca<'2+>超載，可能是HN拮抗Aβ神經(jīng)毒發(fā)揮保護作用的重要機制；4)L-型鈣通道可能是HN和Aβ的共同靶點；5)由于觀察到單獨應(yīng)用HN產(chǎn)生了對BK電流和Ca<'2+>電流的抑制作用，由此推測HN對BK的作用可能是通過HN抑制Ca<'2+>通道降低[Ca<'2+>]<,i>，由此產(chǎn)生的對BK電流的抑制，而不是HN對B

10、K通道的直接抑制作用。 第三部分：I型代謝型谷氨酸受體參與脊髓背角痛信號傳遞作用的觀察 近年的研究認為，興奮性氨基酸在脊髓水平痛信號傳遞過程中發(fā)揮非常重要的作用。谷氨酸受體一般分為兩大類：離子型受體(iGluRs)和代謝型受體(mGluRs)。過去的研究大多集中于iGluRs在脊髓水平參與傷害性信息的處理和傳遞過程。但在新近研究中，mGluRs在外周和中樞信息傳遞過程中的作用越來越受到重視。本實驗用福爾馬林注入引起的慢性

11、痛模型，通過脊髓背角Fos蛋白檢測與痛行為反應(yīng)測定，觀察了脊髓水平Ⅰ型mGluRs，包括mGluRl和mGluR5在脊髓痛信息處理和傳遞中所起的作用。 實驗中選取21只SD大鼠，隨機分為3組，兩個實驗組大鼠預(yù)先鞘內(nèi)分別注入mGluR<,1>和mGluR<,5>的特異拮抗劑CPCCOEt和MPEP，一個對照組只在鞘內(nèi)注入等量的藥物溶劑；10分鐘后在三組大鼠均在一側(cè)后腳掌注入福爾馬林(5％，50μl)，隨即進行1h的行為痛反應(yīng)觀察，

12、之后立即灌注固定處死動物，用免疫組化技術(shù)檢測脊髓背角Fos免疫陽性神經(jīng)元(FLI)的數(shù)目。結(jié)果顯示：1.鞘內(nèi)分別注射CPCCOEt和MPEP后，大鼠行為痛反應(yīng)的第二相較對照組均減弱約50％(每組n=7；CPCCOEt組，P<0.05；MPEP組，P<0.01)，而第一相痛行為反應(yīng)在兩個鞘內(nèi)給藥組和對照組間無顯著變化；2.分別檢測三組動物福爾馬林注射側(cè)脊髓背角中的Fos免疫陽性神經(jīng)元(FLI)數(shù)目，與對照組相比，CPCCOEt和MPEP注

13、射組分別由對照組的154.9±21.4降低到101.5±21.8(CPCCOEt組，P<0.05)和98.3±17.0(MPEP組，P<0.01)，降幅約30％左右。 上述結(jié)果表明：1.mGluR<,1>和mGluR<,5>在脊髓背角均參與痛信息的感受和傳遞；2.根據(jù)行為痛反應(yīng)觀察，mGluR<,1>和mGluR<,5>只參與福爾馬林所致的第二相的痛信息的傳遞，即參與了慢性痛而不參與急性痛的傳入；3.由于痛行為檢測存在主觀因素影