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文檔簡介
1、新生兒缺氧缺血性腦?。℉ypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是指各種圍生期窒息引起的部分或完全缺氧,腦血流減少或暫停而導(dǎo)致胎兒或新生兒腦損傷。HIE最直接和最嚴(yán)重的后果是神經(jīng)元死亡,保護神經(jīng)元的正常存活,減少死亡是研究和解決神經(jīng)系統(tǒng)疾病的最重要策略之一。
TRPC(transient receptor potential canonical)是一種非特異性陽離子通道,它在體內(nèi),尤其在神經(jīng)系統(tǒng)廣
2、泛表達,是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)重要的離子通道,被認(rèn)為最可能的鈣庫操縱性鈣通道的分子基礎(chǔ)。盡管研究發(fā)現(xiàn)它參與在缺血缺氧性腦損傷過程中的調(diào)節(jié),但是對于TRPC通道的作用也存在爭議。目前,普遍研究認(rèn)為TRPC通過對細胞內(nèi)陽離子的影響,在缺血缺氧性損傷中加重了細胞的損傷,但也有研究發(fā)現(xiàn),TRPC在缺血缺氧過程中發(fā)揮保護性作用。
哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammaian target of rapamycin,mTOR)是一種非典型的絲
3、氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,mTOR信號通路因處于細胞生長、增殖、存活調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)而備注關(guān)注。調(diào)控mTOR的上游信號分子主要有各種生長因子,Ca2+,氨基酸等。經(jīng)上游信號分子激活后的mTOR通過磷酸化作用一方面活化下游的4E-BP1啟動帽依賴性的蛋白質(zhì)翻譯起始,另一方面可以與核糖體S6蛋白激酶(p70S6K)一起促進蛋白翻譯,同時還調(diào)節(jié)與生長存活相關(guān)的多條信號途徑。目前對mTOR信號通路的研究主要集中在腫瘤的形成與發(fā)展過程中,盡管在缺血缺氧
4、性腦損傷的作用也有報道,但是在HIE中的調(diào)控作用的相關(guān)報道甚少,特別是以TRPC通道作為切入點,結(jié)合mTOR信號通路來研究HIE的發(fā)病機制的相關(guān)報道。
因此本課題以TRPC通道,Ca2+,mTOR信號通路為軸心線索,初步探討TRPC通道在HIE中的作用及機制。
方法
1.離體培養(yǎng)新生Sprague-Dawley(SD)大鼠海馬神經(jīng)元和PC12細胞,給予糖氧剝奪(Oxygen-Glucose Deprivat
5、ion,OGD)建立海馬神經(jīng)元及PC12細胞OGD模型。為了排除阻斷TRPC通道本身對細胞正常功能影響以及OGD建模過程對細胞的損傷,我們設(shè)立了假缺氧模型(sham-OGD)組;又為了排除NMDA受體、AMPA受體及Ca2+通道對實驗可能的影響,我們在阻斷TRPC通道的同時,又再加入MNC(M:MK-80110μmol/L,為NMDA受體阻斷劑; N:Nimodipine2μmol/L,為L-Ca2+通道阻斷劑;C:CNQX10μmol
6、/L,為AMPA受體阻斷劑)。具體實驗分組如下:
a.Control
b.Sham-OGD+SKF96365(0,1,10,25μM)
c.Sham-OGD+MNC+ SKF96365(0,1,10,25μM)}
d.OGD+SKF96365(0,1,10,25μM)
e.OGD+MNC+SKF96365(0,1,10,25μM)}
f.Vehicle
并通過以下指標(biāo)
7、觀察當(dāng)不同程度阻斷TRPC通道時,對OGD神經(jīng)元、OGD-PC12細胞的影響,以確定TRPC通道在缺氧缺血傷害性刺激中對神經(jīng)元的作用性質(zhì)。
a.MTT法檢測細胞存活率
b.LDH檢測細胞膜完整性
c.臺盼藍排斥實驗檢測細胞死亡率
d.Hochest33342染色和流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。
2.在阻斷TRPC通道前后,
a、激光共聚焦檢測OGD海馬神經(jīng)元內(nèi)鈣離子濃度
8、b.Western blot檢測OGD海馬神經(jīng)元mTOR、4E-BP1、p70S6K蛋白以及蛋白的磷酸化表達以初步探討TRPC通道對OGD神經(jīng)元的作用機制
3.數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)統(tǒng)計軟件(SPSS17.0)處理,組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗。
結(jié)果
1.與對照組相比,OGD海馬神經(jīng)元與OGD-PC12細胞的損傷程度與SKF96365濃度呈正相關(guān)。其細胞存活率明顯降低(p<0.05);
9、細胞膜損傷,細胞死亡率與凋亡率均明顯增加(p<0.05)。
2.阻斷TRPC通道后,OGD神經(jīng)元[Ca2+]i明顯下調(diào);p-mTOR、p-4E-BP1、p-p70S6K蛋白明顯下調(diào)(p<0.05)。
結(jié)論
本研究結(jié)果揭示了TRPC通道對缺血缺氧性腦損傷有保護性作用,其機制與TRPC通道經(jīng)調(diào)控[Ca2+]i穩(wěn)態(tài)來調(diào)控mTOR及其下游相關(guān)蛋白的磷酸化有關(guān)。
結(jié)果也提示:TRPC通道可能是治療腦損傷分子
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