硒減緩神經(jīng)元損傷的作用及與線粒體通路關(guān)系的研究.pdf

1、研究目的:
　　探討硒和硒蛋白H（SelH）減緩谷氨酸導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用，及其保護作用與線粒體通路的關(guān)系，為神經(jīng)損傷的防治提供新的思路。
　　研究方法:
　　本實驗利用體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)細(xì)胞（HT-22）及SelH轉(zhuǎn)染的海馬神經(jīng)元細(xì)胞(SelH）及相應(yīng)空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞（HT+V)進(jìn)行實驗。待細(xì)胞處于對數(shù)期生長時，為探討硒對海馬細(xì)胞的保護作用，HT22細(xì)胞分為以下組：①對照組；②谷氨酸組：6mM谷氨酸損傷HT-22

2、細(xì)胞；③亞硒酸鈉組：6mM谷氨酸損傷同時+100nM亞硒酸鈉共同孵育。為探討SelH對減緩谷氨酸對海馬細(xì)胞的損傷作用，分為以下組：①SelH對照組：培養(yǎng)的SelH轉(zhuǎn)染的HT22細(xì)胞不做特殊處理；②SelH谷氨酸組：4mM谷氨酸損傷selH轉(zhuǎn)染細(xì)胞；③HT+V對照組：空載體轉(zhuǎn)染的HT22細(xì)胞不做特殊處理；④HT+V谷氨酸組：4mM谷氨酸處理培養(yǎng)的HT+V細(xì)胞。 MTT法檢測細(xì)胞損傷后6、10和24h的抑制率，倒置顯微鏡及電鏡觀察細(xì)胞大體及

3、細(xì)微結(jié)構(gòu)的變化；DHE探針染色觀察ROS生成情況；MitoTracker Green標(biāo)記線粒體，LysoTracker Red標(biāo)記溶酶體，通過共聚焦顯微鏡觀察自噬形成過程；免疫熒光化學(xué)和western-blotting法檢測線粒體通路凋亡相關(guān)因子caspase-9、caspase-3及Apaf-1在不同處理組細(xì)胞中的表達(dá)。
　　研究結(jié)果:
　　第一部分：①6mM的谷氨酸可使得培養(yǎng)的HT-22細(xì)胞在6h時出現(xiàn)8.71％±0.0

4、09抑制率，隨著時間的增加，培養(yǎng)的細(xì)胞抑制率逐漸增加，但是亞硒酸鈉組抑制率顯著下降（P<0.05）。②對照組 HT-22細(xì)胞形態(tài)正常，胞膜、胞核完整，細(xì)胞器豐富；細(xì)胞內(nèi)可見雙層胞核完整，線粒體嵴清晰，胞質(zhì)內(nèi)有發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)正常、顆粒分布均勻完整；而谷氨酸組可見凋亡細(xì)胞增多，凋亡細(xì)胞胞核不完整甚至消失，胞核碎裂，細(xì)胞器明顯減少；細(xì)胞內(nèi)雙層胞核模糊不清，線粒體結(jié)構(gòu)破壞，輪廓不辨甚至消失。胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量溶酶體，大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度

5、擴張、顆粒不完整。大量細(xì)胞胞核消失，核仁崩解碎裂，細(xì)胞器稀少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度腫脹，在胞內(nèi)形成大空泡結(jié)構(gòu)。亞硒酸鈉組細(xì)胞相較損傷組損傷明顯減少。③ROS特異性標(biāo)記探針DHE標(biāo)記結(jié)果提示,對照組幾乎不產(chǎn)生ROS，而谷氨酸組中ROS產(chǎn)生明顯增加，使用亞硒酸鈉干預(yù)后ROS產(chǎn)生明顯減輕（P<0.05）。④線粒體特異性標(biāo)記探針Mito Tracker Green、溶酶體特異性標(biāo)記探針Lyso Tracker red對各處理條件下的細(xì)胞進(jìn)行雙重標(biāo)記觀察到

6、對照組線粒體綠色熒光染料著色清晰，輪廓清楚，溶酶體幾乎不著色，而谷氨酸組中線粒體的染色明顯減少，溶酶體染色明顯加強（P<0.05），提示：自噬小體的發(fā)生增加。在亞硒酸鈉組，自噬現(xiàn)象得到明顯改善。⑤免疫熒光化學(xué)和western-blotting檢測結(jié)果表明：與損傷組比較，亞硒酸鈉組線粒體依賴的凋亡途徑關(guān)鍵因子caspase-3、9及Apaf-1的表達(dá)是明顯下降的（P<0.05）。
　　第二部分：①MTT結(jié)果證明，4mM谷氨酸作用6h

7、后，培養(yǎng)的HT+V、SelH開始被抑制，隨著谷氨酸損傷時間的延長(10h和24h)，培養(yǎng)的HT22細(xì)胞抑制率也逐漸增加，SelH轉(zhuǎn)染的細(xì)胞抑制率明顯低于空載體轉(zhuǎn)染的HT22細(xì)胞（P<0.05）。②對照組的SelH和HT+V組細(xì)胞形態(tài)正常，胞膜、胞核完整，細(xì)胞器豐富；細(xì)胞內(nèi)可見雙層胞核完整，線粒體嵴清晰，胞質(zhì)內(nèi)有發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)正常、顆粒分布均勻完整；谷氨酸損傷后，SelH和HT+V組均可見凋亡細(xì)胞增多，凋亡細(xì)胞胞核不完整甚至

8、消失，胞核碎裂，細(xì)胞器明顯減少；細(xì)胞內(nèi)雙層胞核模糊不清，線粒體結(jié)構(gòu)破壞，輪廓不辨甚至消失。胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量溶酶體，大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度擴張、顆粒不完整。大量細(xì)胞胞核消失，核仁崩解碎裂，細(xì)胞器稀少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度腫脹，在胞內(nèi)形成大空泡結(jié)構(gòu)。與SelH谷氨酸組相比較，vector損傷組細(xì)胞凋亡細(xì)胞明顯增加（P<0.05）。③DHE檢測結(jié)果顯示：對照組幾乎不產(chǎn)生ROS，谷氨酸組HT22細(xì)胞ROS產(chǎn)生明顯增加。相對HT+V組，SelH組谷氨酸損傷后RO

9、S產(chǎn)生是明顯較少的（P<0.05）。④線粒體及溶酶體雙標(biāo)觀察提示：各對照組線粒體綠色熒光染料著色清晰，輪廓清楚，溶酶體幾乎不著色，谷氨酸組中線粒體的染色明顯減少，溶酶體的染色明顯加強，自噬小體的發(fā)生增加，vetor谷氨酸組較SelH谷氨酸組自噬現(xiàn)象更為明顯。⑤免疫熒光化學(xué)和western-blotting檢測結(jié)果表明：與對照組比較，HT+V組谷氨酸組線粒體依賴的凋亡途徑關(guān)鍵因子caspase-3、9及Apaf-1的表達(dá)是明顯上升的（P<