活化ARE通路對運動神經元保護作用的研究.pdf

1、肌萎縮側索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis ALS)是一個致命的神經變性疾病。它的主要病理改變是選擇性地損傷運動神經元(包括大腦皮層運動神經元、腦干運動神經核和脊髓前角運動神經元)。臨床表現(xiàn)為緩慢進展的四肢無力，累及呼吸肌，多于發(fā)病3-5年內死亡。ALS 可分為家族型肌萎縮側索硬化(Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis，F(xiàn)ALS)和散發(fā)型肌萎縮側索硬化(Sporad

2、ic Amyotrophic Lateral Sclerosis，SALS)，90％以上為散發(fā)型不足lO％為家族型。 其中FALS主要是由于編碼Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)的基因突變引起，其突變位點在21號染色體長臂Cu/Zn SOD 基因內，即21q22.1-22.2。與ALS有關的SOD1基因的突變大約有100余種。在這些突變中SOD酶的活性基本正?；蛏?，SOD基因敲除的小鼠則沒有發(fā)病。這些發(fā)現(xiàn)提示SOD1相關的A

3、LS不是因為功能缺失而引起，而是可能由一種獲得性毒性引起。 在運動神經元變性過程中牽涉到幾個機制：興奮毒性、免疫反應、線粒體功能障礙及自由基損傷、蛋白質異常聚積、蛋白酶體功能改變和凋亡。雖然這些通路對運動神經元損傷的啟動和進展都起作用，但是這些通路之間的相互反應以及哪個起主要作用還不明了。 這些機制不是互相排斥的而是可以被一個共同的反應所激活，這一共同的反應的協(xié)調者正是氧化應激。盡管確切機制尚不明了，但在導致運動神經元損

4、傷的過程中，增加的氧化應激是出現(xiàn)較早且持久的事件。氧化應激不僅在ALS的發(fā)病中起了突出的作用，并且它通過活化其它各個通路，引起更新一輪的氧化應激，促進了疾病的進展。所以許多研究的焦點集中在氧化應激和自由基損傷。 哺乳動物細胞內還原型谷胱甘肽(glutathione GSH)是細胞內含量最豐富、最有效的反應氧族(reactive oxygen species ROS)的直接清除劑。通過GSH 與氧化型谷胱甘肽(GSSG)的轉換來調

5、節(jié)ROS水平，GSH 減少則ROS產生增加并促進氧化損傷。 另外GSH也是許多抗氧化酶的關鍵底物，這些酶解毒過氧化氫和脂質過氧化的產物。正如CHI.L和KE.Y 等應用離體和在體的實驗證實那樣，GSH的缺失加強了運動神經元的變性。 GSH的合成是一個ATP依賴的兩步酶促反應。第一步由γ-谷氨酸半胱氨酸連接酶(γ-Glutamate Cysteine ligase GCL)催化完成，第二步由GSH 合成酶(GSH synt

6、hetase)催化完成。前者是重要的限速酶。分別有GCLC和GCLM兩個亞單位組成。隨著年齡的老化，在大鼠中樞神經系統(tǒng)組織GCLM基因表達的下調，伴隨著GCL酶活力的減低和GSH 水平的降低。說明在與年齡相關的神經變性疾病中GCL及GSH發(fā)揮重要作用。 由谷胱甘肽S一轉移酶(Glutathione S-transferase GST)家族是一個分布廣泛，包括近百種同工酶在內的多基因大家族。GSTs屬Ⅱ相酶防御系統(tǒng)。具有多種生物學

7、功能如催化包括親電子試劑(electrophiles)、致癌物(carcinogens)和有基因毒性、細胞毒性的異生化合物(xenobiotics)與還原型谷胱甘肽(GSH)連接，使其轉變?yōu)橛H水的易排泄物質。GST 在神經細胞氧化防御方面起重要作用。所以誘導內源性Ⅱ相酶，如GST 已經被提議作為治療PD的方法和癌癥的化學預防。 本課題根據(jù)谷氨酸的慢性興奮毒性機制，應用谷氨酸轉運體抑制劑蘇一羥天冬氨酸(THA)，抑制星形膠質細胞對

8、細胞外谷氨酸的轉運，最終導致運動神經元死亡。制備成慢性選擇性運動神經元損傷的脊髓器官型培養(yǎng)模型。 總之，慢性選擇性運動神經元損傷的脊髓器官型培養(yǎng)模型為神經保護劑在人類運動神經元疾病的臨床試驗和臨床前試驗間提供了密切的聯(lián)系。該模型已經成功地預言了力如唑(riluzole)和加巴噴丁(neurontin)有效的運動神經元保護作用，這兩種藥已經用于人類運動神經元病。故本課題利用該模型，以誘導內源性抗氧化劑為切入點尋求理想的治療靶點。

9、 在許多神經變性疾病的病因涉及到神經細胞內ROS 的堆積，細胞中和這些反應中間產物的能力很大程度上依賴一個順式作用元件的活化，這個順式作用元件被命名為抗氧化反應元件(antioxidant response elementARE)。它存在于抗氧化蛋白和解毒酶基因的5’端區(qū)域。在人類、大鼠、小鼠的多種組織中及原代培養(yǎng)的星形膠質細胞、神經元中都已證實，ARE驅動的靶基因包括GCLC、GLCM 和GSTs等。 所以，本課題應用A

10、RE活化劑，觀察其在該模型中對運動神經元的作用，并進一步探討作用機制。 論文共分四部分： 第一部分證實ARE活化劑對運動神經元確實存在保護作用。 第二部分探討這種保護作用伴隨著該模型中GSH水平和Ca<'2+>水平的變化，而與P75<'NTR>水平無關。 第三部分進一步證實GSH合成的限速酶GCL 在該模型中存在異常，隨著ARE的保護作用，GCL的基因水平發(fā)生改變，說明GSH水平的改變是其上游合成酶變化引