他克莫司對(duì)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、急性脊髓損傷(Acute Spinal Cord Injury，ASCI)是一類非常嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，常導(dǎo)致?lián)p傷平面之下的運(yùn)動(dòng)和感覺功能全部或部分喪失。脊髓損傷患者一生需要的治療費(fèi)用非常昂貴，治療效果又不理想，所以給個(gè)人和家庭都帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。因此，怎樣提高治療急性脊髓損傷的效果，恢復(fù)或者減少其所造成的神經(jīng)功能損害，讓患者重新回歸到正常的社會(huì)生活工作中來，具有非常重要的意義。
　　他克莫司(Tacrolimus，F(xiàn)K

2、506)商品名普樂可復(fù)，已經(jīng)通過美國(guó)FDA驗(yàn)證，1984年由日本藤澤制藥公司在筑波泥土的鏈霉菌里提取出來的發(fā)酵產(chǎn)物，其屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，臨床上具有很強(qiáng)的免疫抑制作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)K506的受體蛋白FKBP(FK506 Binding Protein)不但存在于免疫系統(tǒng)中，并且在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的也極為豐富，并是前者的10～50倍。但是，他克莫司作為免疫抑制類藥物雖然具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)的作用，同時(shí)也具有神經(jīng)毒性作用，研究表明其神經(jīng)毒性作用

3、與藥物的濃度有關(guān)，所以如何在發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用的同時(shí)避免產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用是一個(gè)難點(diǎn)。目前關(guān)于FK506的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)與神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制尚不清楚，同時(shí)也沒有關(guān)于他克莫司對(duì)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元缺血缺氧損傷保護(hù)作用方面的研究。實(shí)驗(yàn)中我們通過成功建立新生大鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的培養(yǎng)體系，進(jìn)而篩選適宜運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長(zhǎng)的最佳他克莫司藥物濃度。在獲得最佳藥物濃度后構(gòu)建脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元缺血缺氧模型，設(shè)立對(duì)照組和藥物組，觀察并研究他克莫司的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)及保護(hù)作用并闡

4、述其相關(guān)的機(jī)制。本研究填補(bǔ)了目前沒有關(guān)于他克莫司對(duì)于脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元缺血缺氧保護(hù)作用研究的空白，同時(shí)也為他克莫司的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用提供進(jìn)一步的研究支持，為臨床上利用他克莫司治療急性脊髓損傷疾病給予了新的理論依據(jù)。
　　本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 新生大鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的純化培養(yǎng)與鑒定
　　目的:探討新生大鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的分離、純化和培養(yǎng)方法，并予以分類鑒定，測(cè)定脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元純度及存活率，建立新生大

5、鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的純化培養(yǎng)體系。
　　方法:取新生大鼠的脊髓腹側(cè)組織分離消化成細(xì)胞懸液，經(jīng)密度梯度離心及差速貼壁后純化培養(yǎng)，5d后運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)雙標(biāo)染色法對(duì)培養(yǎng)蓋片上的細(xì)胞進(jìn)行分類和鑒定，計(jì)數(shù)隨機(jī)50個(gè)視野中各細(xì)胞成分的平均含量。初接種后隨機(jī)選取50個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以0d的細(xì)胞數(shù)目均值作為基數(shù)100％。繼續(xù)在培養(yǎng)后的1、3、5d各時(shí)間點(diǎn)用上法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并進(jìn)行存活率計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況良好，神

6、經(jīng)元細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的85.8％。其中，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞占總數(shù)的71.6％，星形膠質(zhì)細(xì)胞占總數(shù)的7.8％，非神經(jīng)元細(xì)胞占總數(shù)的6.4％。神經(jīng)元細(xì)胞的存活數(shù)目較多，5d后神經(jīng)元細(xì)胞的存活率仍保持在57.8％左右。
　　結(jié)論:取新生大鼠的腹側(cè)脊髓組織并結(jié)合密度梯度離心法和差速貼壁接種法可以培養(yǎng)出高純度的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，同時(shí)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的高存活率也保證了應(yīng)用運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。
　　第二部分 他克莫司對(duì)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)

7、元保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:尋找他克莫司(FK506)促進(jìn)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長(zhǎng)的最佳濃度，觀察其對(duì)缺血缺氧的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有無保護(hù)作用，并探討其可能的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:取已培養(yǎng)3d的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞分別加入不同濃度的他克莫司，分為:空白對(duì)照組（A組）、100pmol/L FK506組（B組）、1nmol/LFK506組（C組）和10nmol/L FK506組（D組），繼續(xù)培養(yǎng)2d，通過細(xì)胞免疫化學(xué)法觀察神經(jīng)

8、元細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法）檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞的活力，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（RT-PCR法）檢測(cè)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白—43信使核糖核酸(GAP-43mRNA)的表達(dá)情況。在獲得了FK506的最佳濃度后，另取一部分脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分為對(duì)照組，缺血缺氧組，F(xiàn)K506治療組，將已培養(yǎng)3d的缺血缺氧組和FK506治療組的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，同時(shí)用石蠟油封閉各孔造成缺氧條件。缺血缺氧組在損傷的前一天每孔給予0.01mo

9、l/L pH7.2的PBS800μl，F(xiàn)K506治療組在損傷前一天每孔加入已得到的最佳濃度FK506800μl，繼續(xù)培養(yǎng)2d，對(duì)照組不做任何處理。通過免疫熒光法觀察各組神經(jīng)元細(xì)胞生長(zhǎng)情況，MTT法檢測(cè)各組神經(jīng)元細(xì)胞活力，RT-PCR法檢測(cè)各組神經(jīng)元細(xì)胞GAP-43mRNA的表達(dá)，Western-blot法檢測(cè)在加入FK506后各時(shí)間點(diǎn)ERK、p-ERK、GAP43等蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:1nmol/L FK506組（C組）的

10、新生大鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量和突起長(zhǎng)度明顯優(yōu)于A組、B組和D組。同時(shí)C組的MTT吸光度OD值及GAP-43mRNA的相對(duì)表達(dá)量也明顯高于A組、B組和D組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。缺氧缺血造模后的免疫熒光結(jié)果顯示，F(xiàn)K506治療組的神經(jīng)元數(shù)量和突起長(zhǎng)度均明顯優(yōu)于缺血缺氧組，F(xiàn)K506治療組的MTT吸光度OD值及GAP-43mRNA的表達(dá)量也均明顯高于缺血缺氧組，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。Western-blot結(jié)果顯

11、示，在加入FK506作用不同時(shí)間點(diǎn)后，F(xiàn)K506治療組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元p-ERK的表達(dá)量較缺血缺氧組均有顯著增加，并在4小時(shí)后達(dá)到頂峰，而GAP-43的表達(dá)在8小時(shí)后達(dá)到頂峰。
　　結(jié)論:對(duì)新生大鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長(zhǎng)促進(jìn)和保護(hù)作用的FK506最佳濃度是1nmol/L。FK506可提高體外缺血缺氧損傷的新生大鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的細(xì)胞活性，并增加p-ERK和GAP-43在脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的表達(dá)。其中p-ERK開始表達(dá)的時(shí)間和達(dá)峰時(shí)間均早于的G

12、AP-43，支持GAP-43為p-ERK下游表達(dá)分子的觀點(diǎn)，提示缺氧缺血后ERK的活化可增加GAP-43的表達(dá)，而后者則具有促神經(jīng)再生和神經(jīng)修復(fù)的作用。
　　第三部分 他克莫司治療大鼠急性脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:觀察他克莫司(FK506)對(duì)大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能的改善作用并探討可能的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:隨機(jī)將72只健康SD大鼠分成三組:假手術(shù)組、損傷模型組、FK506治療組，其中損傷模型組和FK506治療組采用

13、Allen's法擊傷大鼠T10脊髓制造大鼠急性脊髓損傷模型，假手術(shù)組僅做椎板切除術(shù)。其中FK506治療組于術(shù)后10分鐘給予0.3mg/kg的FK506腹腔注射，之后每天注射1次，連續(xù)2周，其余兩組均給予等體積的生理鹽水。造模后每組根據(jù)取材時(shí)間進(jìn)一步分為術(shù)后1、2、4、6h四小組，每小組6只，測(cè)定脊髓損傷處組織MDA、SOD、NO含量。造模后1、3、7、14、21d采用甲苯胺藍(lán)染色觀察脊髓組織病理學(xué)改變，并進(jìn)行脊髓功能BBB評(píng)分及斜板實(shí)驗(yàn)

14、評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況。
　　結(jié)果:傷后1、3、7、14、21d FK506治療組脊髓損傷區(qū)出血及壞死情況均較損傷模型組輕，而斜板實(shí)驗(yàn)和BBB評(píng)分均明顯優(yōu)于損傷模型組，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，損傷模型組與FK506治療組MDA、SOD及NO含量在損傷后1h未見明顯差異，而在損傷后2h、4h和6h顯示FK506治療組對(duì)急性脊髓損傷后MDA及NO含量的升高具有明顯的抑制作用，對(duì)SOD含量的降低有明顯的提升作用，具