Shh蛋白對(duì)皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長(zhǎng)作用及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目前，腦血管病已成為人類(lèi)死亡的首要疾病，并且具有患病率高、致殘率高、死亡率高、復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，其中腦梗死約占腦血管病的85％，因此研究和防治腦梗死具有極其重要的社會(huì)意義。據(jù)報(bào)道對(duì)腦梗死的的治療效果不盡如人意，腦梗死后神經(jīng)功能的損傷是患者致殘的主要原因。神經(jīng)元突起損傷是導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙的重要原因。如何促進(jìn)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)是腦梗死后期治療的關(guān)鍵。
　　腦梗死導(dǎo)致腦組織受到不同程度的損傷，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致神經(jīng)功能受損。而神經(jīng)

2、可塑性又可以促使形成新的豐富神經(jīng)網(wǎng)路結(jié)構(gòu)并能修復(fù)病變，從而改善缺血腦組織的神經(jīng)功能。因此研究給予藥物等加強(qiáng)神經(jīng)修復(fù)的作用顯得尤為重要。由于神經(jīng)元突起對(duì)于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的修復(fù)具有重要意義，因此，尋找能夠有效促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的藥物，是當(dāng)前面臨的重要并且熱點(diǎn)課題。
　　Sonic hedgehog(Shh)是分泌性糖蛋白因子，在胚胎和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、發(fā)育和分化中可調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化和軸突的形成。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道大鼠腦缺血中，Shh可通

3、過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化和突起的形成發(fā)生來(lái)促進(jìn)神經(jīng)元可塑性，并且參與調(diào)控腦組織室下區(qū)神經(jīng)再生。然而，到目前為止，查閱大量文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)Shh蛋白對(duì)大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞神經(jīng)突起的作用及其機(jī)制仍未明確，仍需深入研究，這對(duì)增強(qiáng)神經(jīng)環(huán)路的研究具有重要意義。
　　氧化應(yīng)激是腦梗死的重要病理生理機(jī)制，應(yīng)用氧化應(yīng)激模型有助于理解腦梗死的發(fā)病機(jī)理并開(kāi)展相關(guān)治療。因此本課題利用皮層神經(jīng)元的氧化應(yīng)激模型來(lái)模擬腦梗死后皮層神經(jīng)元的損傷，研究Shh蛋白對(duì)氧化

4、應(yīng)激下皮層神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　線(xiàn)粒體是能量產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，可在控制神經(jīng)重構(gòu)包括神經(jīng)分化、神經(jīng)突生長(zhǎng)、神經(jīng)遞質(zhì)釋放以及樹(shù)突重構(gòu)等的基本過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。線(xiàn)粒體功能失調(diào)可能在腦梗死后神經(jīng)重塑中具有重要作用。調(diào)節(jié)腦梗死后線(xiàn)粒體的形態(tài)和功能可以介導(dǎo)神經(jīng)突起的生長(zhǎng)，而神經(jīng)突起的生長(zhǎng)是一個(gè)能量消耗的過(guò)程，需要足夠的能量供應(yīng)，因此，能量的代謝和線(xiàn)粒體與神經(jīng)突起的生長(zhǎng)高度相關(guān)。研究報(bào)道激活經(jīng)典的Shh調(diào)節(jié)的信號(hào)通路可以增加線(xiàn)粒體活性

5、。但是關(guān)于Shh對(duì)于氧化應(yīng)激后皮層神經(jīng)元線(xiàn)粒體的影響報(bào)道較少，仍需深入研究。
　　綜上所述，本研究首先利用孕15-18天C57BL/6胎鼠確立小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng)模型，其次利用此模型觀(guān)察Shh蛋白對(duì)皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，并探討其可能的影響機(jī)制，最后利用皮層神經(jīng)元的氧化應(yīng)激模型來(lái)模擬腦梗死，觀(guān)察Shh對(duì)皮層神經(jīng)元的活性和神經(jīng)突起的作用，并從線(xiàn)粒體和能量代謝的角度探討Shh對(duì)氧化應(yīng)激下皮層神經(jīng)元及其突起發(fā)揮保護(hù)作

6、用的機(jī)制。本研究分為三部分，現(xiàn)將各部分內(nèi)容概述如下。
　　第一部分小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng)及細(xì)胞鑒定
　　目的：通過(guò)對(duì)孕15-18天內(nèi)C57BL/6胎鼠皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)，掌握小鼠皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)方法，并觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)；利用免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞是否為神經(jīng)元細(xì)胞，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　方法：C57BL/6雌雄小鼠交配獲取孕15-18天胎鼠，麻醉后斷頭取腦，于預(yù)冷1×HBSS溶液的平皿中，在解剖顯微鏡下取

7、出完整的大腦及小腦，夾除小腦，將大腦半球放入盛有預(yù)冷的1×HBSS溶液的平皿中，在解剖顯微鏡下剝離腦膜，分離出皮層組織。將其剪碎放入15ml塑料離心管離心管內(nèi)加入3ml Papain消化液（新鮮配制），37°C孵育箱內(nèi)孵育15~30分鐘棄去Papain消化液，加入3ml Hibernate E洗滌，反復(fù)直至變成細(xì)胞懸液，200 rpm離心3分鐘，棄去上清，加入含2%B27的Neurobasal培養(yǎng)液，制成單細(xì)胞懸液，種植于 Poly-L

8、-lysine處理過(guò)的培養(yǎng)皿中，于濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃，5% CO2），并于不同時(shí)間點(diǎn)于顯微鏡下觀(guān)察所培養(yǎng)的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)情況并記錄。取培養(yǎng)1天皮層神經(jīng)元，4%多聚甲醛固定，0.3% triton-X100破膜打孔作用15分鐘，10%驢血清室溫封閉45分鐘，加入抗鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron specific enolase，NSE)和兔抗鼠的膠質(zhì)細(xì)胞中間絲蛋白膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial fibrillary

9、acidic protein, GFAP）一抗4℃過(guò)夜，然后加入驢抗小鼠FITC(1:200)，驢抗兔TRITC(1:200)，37℃，1 h，熒光封片劑后于熒光顯微鏡下觀(guān)察神經(jīng)元并鑒定神經(jīng)元細(xì)胞。
　　結(jié)果
　　1皮層神經(jīng)元細(xì)胞剛接種時(shí)的細(xì)胞為圓形，2小時(shí)后開(kāi)始貼壁，培養(yǎng)至6~8小時(shí)后，少數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞可見(jiàn)有明顯的細(xì)胞突起的生成。培養(yǎng)第24小時(shí)后，神經(jīng)元細(xì)胞胞體清晰、豐滿(mǎn)，胞體呈現(xiàn)錐體或星形，光暈的輪廓較明顯，細(xì)胞突起增長(zhǎng)。

10、培養(yǎng)第2天，細(xì)胞胞體增大，更清晰，突起明顯變長(zhǎng)，而且突起之間形成了一定的聯(lián)系。培養(yǎng)第3天，絕大多數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞的突起已經(jīng)相互連接，并形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。
　　2本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)發(fā)現(xiàn) NSE標(biāo)記的神經(jīng)元細(xì)胞在視野中出現(xiàn)較多，并顯示出完整的神經(jīng)元形態(tài)，而且細(xì)胞胞體豐滿(mǎn)，突起生長(zhǎng)較多；視野中未發(fā)現(xiàn)GFAP標(biāo)記的膠質(zhì)細(xì)胞。
　　結(jié)論
　　1本實(shí)驗(yàn)利用無(wú)血清培養(yǎng)法成功建立了小鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng)模型，具有穩(wěn)定性高、純度

11、高和存活率高的皮層神經(jīng)元細(xì)胞，是一種研究神經(jīng)科學(xué)的理想模型。
　　2本試驗(yàn)利用免疫熒光法對(duì)所培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞的鑒定結(jié)果提示對(duì)胎鼠腦皮層細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)獲得的神經(jīng)元細(xì)胞存活率高，純度高，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下了良好的基礎(chǔ)。
　　第二部分Shh蛋白對(duì)皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的作用及與BDNF機(jī)制研究
　　目的：觀(guān)察Shh蛋白對(duì)小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞神經(jīng)突起的生長(zhǎng)作用，并探討Shh蛋白對(duì)皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的作用及其相關(guān)的可能機(jī)制。
　　方

12、法：取孕15-18天的C57BL/6小鼠的原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為對(duì)照組、不同濃度的Shh（5,50,500ng/ml）組、Shh信號(hào)通路抑制劑環(huán)耙明（cyclopamine, CPM）組、CPM+Shh組和酪氨酸激酶抑制劑K252a+Shh組。抑制劑在加入Shh蛋白前30min提前加入，藥物作用于神經(jīng)元細(xì)胞24小時(shí)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用免疫熒光法檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞中Shh受體（Ptch）的表達(dá)；β-Tubulin免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染

13、色法測(cè)定 Shh對(duì)皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長(zhǎng)長(zhǎng)度；RT-qPCR法檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞中 Shh和Ptch基因水平表達(dá)；RT-qPCR和Western-bloting法檢測(cè)神經(jīng)元細(xì)胞中BDNF基因和蛋白水平表達(dá)；免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法測(cè)定神經(jīng)元神經(jīng)突BDNF的含量；按照BDNF試劑盒說(shuō)明書(shū)采用ELISA法測(cè)定神經(jīng)元培養(yǎng)液中BDNF的含量。
　　結(jié)果
　　1首先證實(shí)Shh受體—Ptch在皮層神經(jīng)元細(xì)胞存在，提示Shh蛋白可能對(duì)調(diào)節(jié)皮層

14、神經(jīng)元神經(jīng)突的生長(zhǎng)具有生物學(xué)效應(yīng)。
　　250 ng/ml和500 ng/ml的Shh蛋白組能夠明顯促進(jìn)神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長(zhǎng)（P<0.05）。特別有趣的是，50ng/ml的Shh蛋白組對(duì)神經(jīng)突起的生長(zhǎng)的促進(jìn)作用更加明顯，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用Shh濃度為50ng/ml進(jìn)行。
　　3與單用Shh蛋白組相比， Shh和CPM共同作用后能夠顯著降低神經(jīng)突起的長(zhǎng)度（P<0.05），提示Shh介導(dǎo)的神經(jīng)突起的生長(zhǎng)作用部分能被CPM阻斷。<

15、br>　　4 Shh蛋白干預(yù)均能夠誘導(dǎo)細(xì)胞中Shh和Ptch的基因表達(dá)增加，給予CPM后，Shh誘導(dǎo)細(xì)胞中Shh和Ptch基因表達(dá)增加均部分被抑制(P<0.05)。
　　5 Shh蛋白干預(yù)能夠使神經(jīng)元細(xì)胞BDNF在mRNA和蛋白水平上增加，給予CPM后，Shh介導(dǎo)的BDNF的表達(dá)增加被抑制(P<0.05)。
　　6 Shh蛋白干預(yù)能夠使神經(jīng)元細(xì)胞的神經(jīng)突起中BDNF表達(dá)增加，與CPM聯(lián)用后，這種增加部分被抑制。
　　7

16、 Shh蛋白干預(yù)能夠使細(xì)胞培養(yǎng)液中BDNF的含量也增加，給予CPM后，細(xì)胞培養(yǎng)液中BDNF的含量增加也被抑制(P<0.05)。
　　8與單用Shh組相比，K252a和Shh聯(lián)合作用組對(duì)皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長(zhǎng)長(zhǎng)度有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：本試驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞中存在 Shh受體-Ptch，并且Shh蛋白能夠促進(jìn)皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長(zhǎng)，Shh蛋白可能部分通過(guò)激活Shh信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)其對(duì)

17、腦皮層神經(jīng)元的神經(jīng)突起的促生長(zhǎng)作用；此外Shh蛋白還可能通過(guò)促進(jìn)BDNF的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其對(duì)神經(jīng)突起的促生長(zhǎng)作用，最終實(shí)現(xiàn)Shh蛋白的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第三部分 Shh蛋白對(duì)氧化應(yīng)激下皮層神經(jīng)元活性和神經(jīng)突起的作用及其線(xiàn)粒體機(jī)制研究
　　目的：觀(guān)察Shh蛋白對(duì)氧化應(yīng)激下小鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞的活性影響和神經(jīng)突起的生長(zhǎng)作用的影響，觀(guān)察Shh蛋白對(duì)氧化應(yīng)激下皮層神經(jīng)元細(xì)胞中活性氧（Reactive Oxygen Species, RO

18、S）、超氧化物岐化酶（Superoxide Dismutase，SOD）及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的影響，并檢測(cè)Shh蛋白對(duì)氧化應(yīng)激下線(xiàn)粒體形態(tài)和功能的影響以及對(duì)能量代謝和線(xiàn)粒體氧化呼吸鏈復(fù)合物酶II的影響，進(jìn)而探討Shh蛋白對(duì)氧化應(yīng)激下皮層神經(jīng)元的活性和神經(jīng)突起的作用及其可能的線(xiàn)粒體和能量代謝機(jī)制。
　　方法：取孕15-18天C57BL/6小鼠的胎鼠，取其皮層組織，進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)。皮層神經(jīng)元培養(yǎng)24小時(shí)

19、后，加入100 uM H2O2處理2h，然后換液繼續(xù)以神經(jīng)元培養(yǎng)液培養(yǎng)，體外模擬腦缺血模型。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、H2O2組、H2O2+Shh組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用CCK-8法檢測(cè)Shh蛋白對(duì)氧化應(yīng)激下皮層神經(jīng)元的細(xì)胞活性的影響；利用β-Tubilin免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法測(cè)定 Shh蛋白對(duì)氧化應(yīng)激下皮層神經(jīng)元神經(jīng)突的長(zhǎng)度的作用；Western-bloting檢測(cè)各組皮層神經(jīng)元細(xì)胞中GAP-43蛋白水平表達(dá)和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法測(cè)定各組中皮層

20、神經(jīng)元細(xì)胞GAP-43的表達(dá)；利用用活性氧檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的ROS的表達(dá)變化，結(jié)果為所檢測(cè)得的熒光值與對(duì)照組的熒光度的比值（%of control）表示；根據(jù)SOD和MDA說(shuō)明書(shū)的說(shuō)明步驟測(cè)定Shh蛋白對(duì)各組細(xì)胞中SOD活性和MDA的含量表達(dá)變化；通過(guò)透射電鏡觀(guān)察各組中皮層神經(jīng)元線(xiàn)粒體形態(tài)的改變；利用線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)檢測(cè)各組神經(jīng)元細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位（MMP）的變化情況。利用ATP活性試劑盒檢測(cè)各組皮層神經(jīng)元

21、ATP活性的變化情況；利用線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物酶 II試劑盒分析各組神經(jīng)元細(xì)胞線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物酶II活性。
　　結(jié)果
　　1 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果H2O2能夠降低神經(jīng)元細(xì)胞的活性，當(dāng)加入Shh蛋白后，細(xì)胞活性的能力增強(qiáng)，50，500 ng/ml的Shh能顯著促進(jìn)氧化應(yīng)激的神經(jīng)元細(xì)胞存活率。
　　2與對(duì)照組相比，神經(jīng)元受到H2O2作用后，其神經(jīng)突起的生長(zhǎng)損傷（P<0.05），而在H2O2作用后加用Shh蛋白后神經(jīng)元神經(jīng)突

22、的生長(zhǎng)得到一定程度的恢復(fù)（P<0.05），結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。應(yīng)用免疫熒光和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中 GAP-43的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 H2O2作用于神經(jīng)元細(xì)胞后GAP-43的表達(dá)降低，而加入Shh蛋白后其表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步證實(shí)Shh蛋白能改善氧化應(yīng)激損傷的皮層神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長(zhǎng)。
　　3與對(duì)照組相比，H2O2作用于皮層神經(jīng)元后，其細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高，SOD活性下降，MDA含量升高，而給

23、予Shh蛋白干預(yù)后，神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)ROS含量下降，SOD活性上升，MDA含量下降（P<0.05）。
　　4透射電鏡顯示，與對(duì)照組相比，H2O2作用后神經(jīng)元內(nèi)的線(xiàn)粒體損傷嚴(yán)重，線(xiàn)粒體腫脹，空泡化，并且結(jié)構(gòu)也破損。當(dāng)加入Shh蛋白干預(yù)后，線(xiàn)粒體形態(tài)得到一定程度的恢復(fù)，空泡化和腫脹的線(xiàn)粒體減少。MMP結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H2O2作用于皮層神經(jīng)元后，神經(jīng)元細(xì)胞的MMP下降，而給予Shh蛋白干預(yù)后，神經(jīng)元細(xì)胞的MMP較之上升（P<0.05

24、）。
　　5 ATP檢測(cè)結(jié)果顯示，H2O2組細(xì)胞的ATP的量與對(duì)照組相比明顯下降，Shh蛋白干預(yù)后，神經(jīng)元細(xì)胞的 ATP量有所好轉(zhuǎn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　6 H2O2作用于神經(jīng)元后線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物酶II的活性下降，而在氧化應(yīng)激后給予Shh蛋白治療后，其活性較H2O2組好轉(zhuǎn)（P<0.05）。
　　結(jié)論：本試驗(yàn)利用氧化應(yīng)激模型模擬腦缺血狀態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)Shh蛋白能促進(jìn)氧化應(yīng)激的皮層神經(jīng)元的存活和神經(jīng)突起