CRH兩型受體對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元突起發(fā)育相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、海馬是中樞邊緣系統(tǒng)的重要腦區(qū)，機(jī)體的許多生理功能如學(xué)習(xí)記憶等與其有著密切的關(guān)系。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)是下丘腦分泌的多肽類激素。近年來發(fā)現(xiàn)，CRH作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)/調(diào)質(zhì)，能通過其受體在情緒反應(yīng)、學(xué)習(xí)記憶以及神經(jīng)系統(tǒng)損傷與發(fā)育等方面發(fā)揮重要的生理作用。CRH受體分為兩型：CRHR1和CRHR2，它們介導(dǎo)了海馬不同的生理功能。目前，有關(guān)CRH兩型受體對海馬神經(jīng)元突起發(fā)育的調(diào)節(jié)作用及其內(nèi)在機(jī)制尚未完全闡明。
　　 前

2、期研究顯示，CRH能促進(jìn)海馬神經(jīng)元突起發(fā)育，但CRH這種作用所涉及的受體機(jī)制尚不清楚。因此，我們以原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元為研究對象，觀察CRH兩型受體對海馬神經(jīng)元突起發(fā)育的調(diào)節(jié)作用。其次，我們研究了CRH兩型受體調(diào)節(jié)神經(jīng)元樹突發(fā)育可能涉及的相關(guān)分子。本課題選擇了兩類神經(jīng)元突起發(fā)育相關(guān)蛋白，塌陷反應(yīng)介導(dǎo)蛋白3(CRMP3)以及動力蛋白類似蛋白1(MKLP1)，觀察CRH兩型受體對它們的調(diào)節(jié)作用；并進(jìn)一步給予PKA、PLC、PKC等蛋白激

3、酶的抑制劑和激動劑，研究CRH兩型受體作用的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 一、CRH兩型受體對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元突起發(fā)育的調(diào)節(jié)
　　 應(yīng)用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)轉(zhuǎn)入原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元中，觀察到CRH能增加神經(jīng)元樹突總長度(TDBL)，而CRH這種作用能被CRHR1特異性的拮抗劑Antalarmin所阻斷，但不能被CRHR2特異性的拮抗劑Astressin2B所阻

4、斷，提示CRHR1激活能促進(jìn)海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育。而僅對CRHR2具有親合力的UrocortinⅡ能減少神經(jīng)元TDBL，提示CRHR2激活能抑制海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育。
　　 二、CRH兩型受體對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元突起發(fā)育相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)
　　 (一)CRH兩型受體對海馬神經(jīng)元CRMP3的調(diào)節(jié)
　　 1.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元上表達(dá)CRMP3蛋白。
　　 2.熒光實(shí)時定量PCR和Wes

5、tern blot的結(jié)果顯示，CRH能減少海馬神經(jīng)元CRMP3 mRNA和蛋白的表達(dá)，呈劑量依賴關(guān)系；進(jìn)一步研究還證實(shí)，CRH對CRMP3表達(dá)的調(diào)節(jié)作用能被CRH受體廣譜的拮抗劑Astressin或CRHR2特異性的拮抗劑Astressin2B所阻斷，但不能被CRHR1特異性的拮抗劑Antalarmin阻斷；而僅對CRHR2具有親合力的UrocortinⅡ能下調(diào)CRMP3的表達(dá)；時間曲線顯示，UrocortinⅡ在6hr內(nèi)即可誘導(dǎo)CRM

6、P3 mRNA的表達(dá)減少，12hr到達(dá)最低值，36hr后仍低于對照組。以上結(jié)果說明，CRHR2激活能抑制海馬神經(jīng)元CRMP3的表達(dá)。
　　 3.Western blot法證實(shí)，UrocortinⅡ可增加海馬神經(jīng)元磷酸化PLC-β3的表達(dá)，而這個作用能被Astressin2B所阻斷。以上結(jié)果證實(shí)，CRHR2能激活PLC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 4.分別給予AC抑制劑SQ22536、PKA抑制劑H89、PLC抑制劑U73122和

7、PKCα/β抑制劑G(o)6976，我們發(fā)現(xiàn)UrocortinⅡ?qū)RMP3表達(dá)的下調(diào)作用可以被U73122或G(o)6976所阻斷，但不受SQ22536或H89的影響，提示CRHR2抑制海馬神經(jīng)元CRMP3水平的作用主要涉及PLC/PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與AC/PKA通路無關(guān)。
　　 (二)CRH兩型受體對海馬神經(jīng)元MKLP1的調(diào)節(jié)
　　 1.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元上表達(dá)MKLP1蛋白。

8、>　　 2.Western blot法證實(shí)，CRH可增加海馬神經(jīng)元MKLP1蛋白的表達(dá)，呈劑量依賴關(guān)系。進(jìn)一步研究還證實(shí)，CRH誘導(dǎo)MKLP1蛋白表達(dá)增加的作用能被Antalarmin所阻斷，但不能被Astressin2B阻斷。以上結(jié)果說明，CRHR1激活能誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元MKLP1蛋白表達(dá)的增加。
　　 3.分別給予SQ22536、H89、U73122和G(o)6976，觀察到它們都不能阻斷CRHR1對MKLP1誘導(dǎo)表達(dá)的作用

9、。進(jìn)一步研究還證實(shí)，CRHR1這一誘導(dǎo)作用也不能被ERK抑制劑PD98059、JNK抑制劑SP600125和p38抑制劑SB203580所阻斷。以上結(jié)果說明，PLC/PKC、AC/PKA和MAPK通路皆不參與CRHR1對MKLP1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)論：
　　 以上結(jié)果表明：CRH兩型受體對原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育具有不同的調(diào)節(jié)作用，其中CRHR1激活能促進(jìn)海馬神經(jīng)元樹突的發(fā)育，而CRHR2的作用則相反。此