TMT對原代海馬神經(jīng)元損傷與BDNF保護(hù)作用研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　三氯甲基錫(Trimethyltin,TMT)是一種重要的職業(yè)危害毒物,也是一種重要的環(huán)境污染物。急性TMT暴露可引起多系統(tǒng)主要包括神經(jīng)系統(tǒng)的損害。TMT作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng),主要損傷作用機(jī)制為引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡,引起神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng),對神經(jīng)組織造成氧化損傷等。TMT可以選擇性地誘導(dǎo)大腦邊緣系統(tǒng),特別是海馬神經(jīng)元死亡,造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷效應(yīng)。研究表明,BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要作用是調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)突觸可塑性。TMT

2、暴露的大鼠大腦BDNF表達(dá)下調(diào),而過表達(dá)BDNF的神經(jīng)元具有拮抗TMT神經(jīng)毒性的作用。但TMT對大腦神經(jīng)元的損傷機(jī)制特別是對神經(jīng)元樹突棘的損傷研究還不清楚,并且BDNF拮抗TMT損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。因此,本課題選取TMT及BDNF為研究內(nèi)容,試圖理解TMT對神經(jīng)元的損傷作用機(jī)制及BDNF保護(hù)作用的分子機(jī)制,并為治療和預(yù)防TMT職業(yè)暴露造成的神經(jīng)元損傷提供思路。
　　突觸可塑性指突觸效率的功能性增強(qiáng)或降低,同時(shí)

3、神經(jīng)信號傳遞強(qiáng)度的變化伴隨著神經(jīng)元突觸的結(jié)構(gòu)變化。并且,BDNF參與調(diào)節(jié)活動依賴的樹突棘發(fā)育及可塑性。近期研究表明BDNF可以作為成年腦中活動依賴性調(diào)節(jié)因子參與調(diào)控神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能變化。BDNF從樹突分泌出來后,立即與神經(jīng)營養(yǎng)因子受體TrkB結(jié)合,進(jìn)而促進(jìn)突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放并且增加突觸后蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯水平。Tau蛋白主要表達(dá)于神經(jīng)元樹突軸,獨(dú)立或與其他微管相關(guān)蛋白協(xié)同調(diào)節(jié)樹突軸微管功能。在神經(jīng)細(xì)胞中,tau蛋白與細(xì)胞膜相聯(lián)系或與微管發(fā)生

4、相互作用。Tau蛋白表達(dá)或者結(jié)構(gòu)的變化可能影響其穩(wěn)定微管蛋白的功能。在生理?xiàng)l件下,tau蛋白可能在不同的位點(diǎn)發(fā)生磷酸化改變,進(jìn)而影響其穩(wěn)定微管的功能。成熟神經(jīng)元可以利用微管的動態(tài)性保持細(xì)胞體系的彈性,以適應(yīng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)發(fā)生的各種變化。
　　方法:
　　第一部分 TMT對神經(jīng)元毒性的觀察
　　以原代培養(yǎng)的胚胎期18天海馬神經(jīng)元為模型,用TMT處理后,用CCK-8的方法觀測BDNF對TMT的保護(hù)作用,觀察TMT處理后神經(jīng)元樹突

5、棘形態(tài)的影響以及BDNF的保護(hù)作用,并明確TMT對神經(jīng)元樹突棘毒性的特征;
　　第二部分 BDNF對神經(jīng)元突觸和樹突棘生長影響的觀察
　　以原代培養(yǎng)的胚胎期18天海馬神經(jīng)元為模型,用 BDNF處理,觀察對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元突觸生長和樹突棘形態(tài)的影響;利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 GFP或 RFP標(biāo)記原代海馬神經(jīng)元樹突棘,細(xì)胞免疫熒光化學(xué)觀測 tau蛋白和微管的共定位情況,突觸綜合體測量BDNF處理后突觸生長的變化,westernblot檢測

6、tau蛋白及其磷酸化變化,明確BDNF處理海馬神經(jīng)元后,神經(jīng)元的形態(tài)突觸可塑性的變化以及tau蛋白所起的作用;
　　第三部分 BDNF對Tau蛋白磷酸化及細(xì)胞分布的觀察
　　以RA分化的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y和原代培養(yǎng)的胚胎期18天海馬神經(jīng)元為模型,用BDNF處理后,采用細(xì)胞免疫熒光化學(xué)的方法觀察tau蛋白的亞細(xì)胞分布情況,Leica軟件測量SH-SY5Y細(xì)胞的突觸生長情況,westernblot檢測tau蛋白表達(dá)變化

7、,明確tau蛋白亞細(xì)胞分布和BDNF處理后細(xì)胞的突觸生長的關(guān)系;
　　結(jié)果:
　　第一部分 TMT引起樹突棘的異常形態(tài)改變
　　TMT處理體外培養(yǎng)14天的原代海馬神經(jīng)元24h,CCK-8檢測細(xì)胞活力顯著下降;加入BDNF與TMT共刺激后,CCK-8檢測細(xì)胞活力無顯著上升。原代海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)7天時(shí)轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒,培養(yǎng)至20天,TMT和/或BDNF處理24h后固定細(xì)胞,共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)TMT處理后神經(jīng)元樹突棘出現(xiàn)異常圓

8、形增大。加入BDNF處理后,樹突棘的異常圓形增大有減少的趨勢。BDNF與LiCl共刺激能夠同樣使神經(jīng)元樹突棘出現(xiàn)與 TMT處理后高度相似的異常圓形增大。Westerbnlot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,BDNF處理后可以同時(shí)在原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元磷酸化 Akt和 ERK。而鋰單獨(dú)似乎不能影響Akt和ERK的磷酸化狀態(tài)。當(dāng)鋰與BDNF同時(shí)作用時(shí),BDNF誘導(dǎo)的ERK的磷酸化沒有影響,但鋰卻抑制BDNF誘導(dǎo)的Akt磷酸化。TMT以及BDNF和LiCl聯(lián)合

9、作用產(chǎn)生的神經(jīng)元樹突棘異常增大可能與ERK與PI3K-Akt之間的cross-talk平衡被破壞有關(guān)。
　　第二部分 BDNF通過tau蛋白調(diào)節(jié)突觸和樹突棘生長
　　BDNF處理體外培養(yǎng)14天的海馬神經(jīng)元24h, Tau蛋白的表達(dá)都顯著升高,Ser262位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)在BDNF刺激后具有下降的趨勢。細(xì)胞免疫熒光化學(xué)實(shí)驗(yàn)也證明tau蛋白與微管蛋白在BDNF處理后的共定位得以增強(qiáng)。BDNF處理后tau蛋白的表達(dá)變化與樹突棘密度

10、的增加一致。運(yùn)用shRNA技術(shù)在體外培養(yǎng)7天時(shí)下調(diào)tau蛋白表達(dá)水平后,培養(yǎng)至21天海馬神經(jīng)元樹突棘密度顯著下降。并且在shRNA下調(diào)tau蛋白的海馬神經(jīng)元中,24h BDNF刺激不能增加神經(jīng)元的樹突棘密度。
　　第三部分 BDNF調(diào)節(jié)tau蛋白的磷酸化與亞細(xì)胞分布
　　通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法,我們發(fā)現(xiàn)在未分化的缺乏神經(jīng)突起的SH-SY5Y細(xì)胞中, tau蛋白形成一個(gè)球體。相反,在維甲酸誘導(dǎo)分化5天的 SH-SY5Y細(xì)胞中,t

11、au蛋白分散分布在神經(jīng)細(xì)胞突起和胞體中。通過Western blot檢測方法,我們發(fā)現(xiàn)維甲酸的處理也增加了總tau蛋白水平而降低tau蛋白Ser262磷酸化水平。Tau蛋白表達(dá)上調(diào)和tau蛋白ser262磷酸化水平的下調(diào)與神經(jīng)細(xì)胞突起長度呈相關(guān)性(相關(guān)因子分別為r=0.94和r=-0.98)。當(dāng)原E18海馬神經(jīng)元用微管解聚劑nocodazole處理后,新生的神經(jīng)元突起丟失并且發(fā)生tau蛋白轉(zhuǎn)移到胞體的現(xiàn)象。這種遠(yuǎn)離突起的過程可以被BDN

12、F一定程度上逆轉(zhuǎn)。
　　研究結(jié)論
　　基于以上研究結(jié)果,我們得出以下研究結(jié)論:TMT處理體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元后發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元的樹突棘出現(xiàn)異常的增大現(xiàn)象,可能是 TMT的神經(jīng)毒性表現(xiàn)。BDNF具有保護(hù)TMT樹突棘損傷的潛力。TMT處理以及BDNF和LiCl聯(lián)合作用產(chǎn)生的神經(jīng)元樹突棘異常增大可能與ERK與Akt之間的cross-talk平衡被破壞有關(guān)。BDNF能夠調(diào)節(jié)原代海馬神經(jīng)元tau蛋白的表達(dá),這樣的調(diào)節(jié)具有劑量依賴關(guān)系和時(shí)效依

13、賴關(guān)系。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元,下調(diào) tau蛋白表達(dá),BDNF刺激神經(jīng)元樹突棘生長的現(xiàn)象被抑制,說明tau蛋白可能參與了BDNF調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸及樹突棘生長的信號通路。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明,BDNF調(diào)節(jié)樹突棘可塑性的作用可能是通過調(diào)節(jié) tau蛋白的表達(dá)量進(jìn)而影響tau蛋白穩(wěn)定微管能力來實(shí)現(xiàn)的;tau蛋白Ser262位點(diǎn)的磷酸化水平,總tau蛋白的表達(dá)量以及tau蛋白的亞細(xì)胞分布變化與神經(jīng)細(xì)胞突觸生長的顯著相關(guān), tau蛋白的表達(dá)增加以及