紅景天苷對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元缺氧損傷保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究紅景天苷對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元缺氧損傷的保護(hù)作用,并探討其可能機(jī)制。
　　 方法:1、選取清潔級(jí)新生SD大鼠,分離海馬神經(jīng)元,進(jìn)行體外原代培養(yǎng)。MAP2免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定神經(jīng)元。2、通過檢測細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca2+]I),確定物理缺氧條件下海馬神經(jīng)元的最佳缺氧時(shí)間,建立缺氧損傷模型。通過MTT法確定化學(xué)缺氧條件下海馬神經(jīng)元的最佳缺氧時(shí)間,建立化學(xué)缺氧損傷模型。3、通過MTT法檢測確定紅景天苷高、中、低劑量組藥物濃度,實(shí)

2、驗(yàn)設(shè)正常對(duì)照組、缺氧損傷模型組、1 mM紅景天苷(高濃度)組,0.25 mM紅景天苷(中濃度)組,15.6μM紅景天苷(低濃度)組,物理缺氧試驗(yàn)中以尼莫地平(0.2μM)為陽性對(duì)照,化學(xué)缺氧試驗(yàn)中以二氮嗪(100μM)為陽性對(duì)照。4、臺(tái)盼藍(lán)及HE染色觀察紅景天苷對(duì)缺氧神經(jīng)元的影響。5、利用熒光分光光度法檢測細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]I,研究各劑量紅景天苷對(duì)海馬神經(jīng)元物理缺氧損傷所致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。6、采用激光共聚焦顯微鏡觀察紅景天苷對(duì)海

3、馬神經(jīng)元物理缺氧所致細(xì)胞損傷的影響。7、通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測物理缺氧模型下各實(shí)驗(yàn)組NMDAR1、Cavl.3 mRNA的表達(dá)差異,化學(xué)缺氧模型下Kir6.2、SUR1 mRNA的表達(dá)差異。8、通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測物理缺氧下各實(shí)驗(yàn)組Calpain1蛋白質(zhì)的表達(dá)差異,通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測化學(xué)缺氧下各實(shí)驗(yàn)組Kir6.2、SUR1蛋白質(zhì)的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果:1、大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng):倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)第7d

4、的海馬神經(jīng)元生長良好,胞體飽滿,胞漿透明,折光良好,細(xì)胞壁完整、光滑,細(xì)胞周圍有光暈,多數(shù)呈多極神經(jīng)元形態(tài),突起延長交錯(cuò)形成網(wǎng)絡(luò)。
　　 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測培養(yǎng)細(xì)胞中神經(jīng)元特異性蛋白MAP2,神經(jīng)元陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示:神經(jīng)元純度達(dá)82.3±7.1％。
　　 2、缺氧損傷模型建立:隨缺氧時(shí)間的延長神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高,3h組[Ca2+]I明顯高于2h組(P'＜0.01),而4h組[Ca2+]I與3h組相比無顯著差

5、異(P＞0.05),確定3h為物理缺氧時(shí)間點(diǎn)。MTT法檢測確定30分鐘為化學(xué)缺氧時(shí)間點(diǎn)。
　　 3、MTT法檢測確定紅景天苷高、中、低劑量組藥物濃度分別為1 mM,0.25 mM,15.6μM。
　　 4、紅景天苷對(duì)體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元缺氧損傷的保護(hù)作用:(1)MTT檢測顯示高、中、低劑量紅景天苷組均可提高缺氧神經(jīng)元存活率,其中高劑量、中劑量(P＜0.01),低劑量(P＜0.05)。(2)臺(tái)盼藍(lán)染色顯示兩種模型中紅景天

6、苷均可減少藍(lán)染死細(xì)胞數(shù)量。(3)HE染色顯示各劑量紅景天苷組與模型組比較可減輕細(xì)胞損傷。(4)物理缺氧實(shí)驗(yàn)中各劑量紅景天苷組與模型組相比較,神經(jīng)元[Ca2+]I顯著降低(高、中劑量組P＜0.01;低劑量組P＜0.05)。(5)激光共聚焦顯微鏡觀察顯示物理缺氧實(shí)驗(yàn)中各劑量紅景天苷組與模型組相比較,鈣離子表達(dá)下降。(6)免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示物理缺氧實(shí)驗(yàn)中模型組Calpain1蛋白的表達(dá)量較正常對(duì)照組升高(P＜0.01);各劑量紅景天苷組

7、與模型組相比,神經(jīng)元Calpain1蛋白的表達(dá)量顯著降低(高、中劑量組P＜0.01;低劑量組P＜0.05)。
　　 5、紅景天苷對(duì)海馬神經(jīng)元缺氧損傷保護(hù)作用的機(jī)制探討:(1)實(shí)時(shí)定量PCR檢測顯示物理缺氧實(shí)驗(yàn)中,模型組NMDAR1 mRNA的表達(dá)量較正常對(duì)照組升高(P＜0.01);各劑量紅景天苷組與模型組比較,神經(jīng)元NMDAR1 mRNA的表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)。模型組Cavl.3 mRNA的表達(dá)量較正常對(duì)照組升高(P＜

8、0.01);高、中劑量紅景天苷組與模型組相比,神經(jīng)元Cavl.3 mRNA的表達(dá)量顯著降低(P＜0.01)?；瘜W(xué)缺氧實(shí)驗(yàn)中,給予連二亞硫酸鈉作用1小時(shí)模型組神經(jīng)元Kir6.2 mRNA、SUR1 mRNA的表達(dá)量較正常對(duì)照組降低(P＜0.01);各劑量紅景天苷組與模型組相比,Kir6.2 mRNA的表達(dá)量顯著升高(P＜0.01)、SUR1 mRNA的表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)。(2)免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示1小時(shí)化學(xué)缺氧試驗(yàn)中高、中

9、、低劑量紅景天苷組與模型組相比,可提高海馬神經(jīng)元Kir6.2蛋白表達(dá)(P＜0.01)。高、中、低劑量紅景天苷組與模型組相比,可提高海馬神經(jīng)元SUR1蛋白表達(dá)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:紅景天苷對(duì)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元物理缺氧及化學(xué)缺氧損傷均有保護(hù)作用。紅景天苷通過下調(diào)物理缺氧神經(jīng)元L-型鈣通道和NMDAR亞基的表達(dá)抑制鈣超載,對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用。紅景天苷通過上調(diào)化學(xué)缺氧神經(jīng)元ATP敏感性鉀通道亞基Kir6.2、SUR1的表達(dá)對(duì)神