紅景天苷通過調(diào)節(jié)MEF2D-ND6通路保護(hù)多巴胺神經(jīng)元.pdf

1、帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一種常見的中樞神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特點為中腦黑質(zhì)致密部（Substantia nigra pars compacta，SNpc）多巴胺（Dopamine, DA）能神經(jīng)元變性死亡缺失。氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙已被廣泛認(rèn)為是PD發(fā)病的主要病理機(jī)制。目前，由于病因及發(fā)病機(jī)制不明確導(dǎo)致PD的臨床治療主要為對癥治療，但是不能阻止或延緩PD的進(jìn)程，而且缺乏有效保護(hù)DA能神經(jīng)元的藥物。

2、
　　肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2（Myocyte enhancer factor2,MEF2）首先在肌細(xì)胞的分化研究中發(fā)現(xiàn)，其不同亞型（包括MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D）在控制細(xì)胞增殖、分化、形態(tài)、生存和凋亡中發(fā)揮中心作用。而MEF2D已被證實與神經(jīng)元的分化和存活密切相關(guān)，并在DA能神經(jīng)元的存活中發(fā)揮關(guān)鍵作用。進(jìn)而研究發(fā)現(xiàn)，MEF2D可在線粒體中表達(dá)，降低線粒體MEF2D表達(dá)水平會明顯抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體I（簡稱線粒體復(fù)

3、合體I）的功能而誘發(fā)神經(jīng)元死亡，而過表達(dá)線粒體靶向MEF2D則可以抵御神經(jīng)毒素誘發(fā)的DA能神經(jīng)元死亡。
　　線粒體DNA（Mitochondrial DNA, mtDNA）是線粒體中的遺傳物質(zhì)，也是細(xì)胞核外唯一具有遺傳效應(yīng)的物質(zhì)。線粒體復(fù)合體I的46個亞基中，7個亞基由mtDNA編碼，其余的39個由核基因編碼并導(dǎo)入至線粒體中，然后與mtDNA編碼的亞基進(jìn)行組裝。NADH脫氫酶（NADH dehydrogenase, ND）是編碼線

4、粒體復(fù)合體I的必要組成部分，僅ND6是由L鏈編碼的蛋白，而其余6個亞基則由H鏈編碼。線粒體中的MEF2D可直接與ND6的MEF2位點結(jié)合以調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控線粒體復(fù)合體I活性和線粒體的功能，該位點發(fā)生突變則會干擾線粒體復(fù)合體I的形成。因此，MEF2D-ND6通路可能是一個潛在治療PD的靶點。
　　紅景天苷（Salidroside, Sal），又名2,4-羥基苯乙基-β-D-葡萄糖苷，是傳統(tǒng)中草藥紅景天的主要活性成分之一。藥理學(xué)研

5、究表明，Sal具有強(qiáng)大的抗氧化特性，而且在抗炎癥、抗缺氧和抗凋亡等方面亦發(fā)揮作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Sal可以改善MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠的行為協(xié)調(diào)能力，提高TH陽性神經(jīng)元的存活數(shù)量，并增加DA含量。而且，Sal還可以通過抑制線粒體凋亡途徑的激活和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡因子，以及調(diào)節(jié)ROS-NO通路、PI3K/Akt通路和激活Nrf2以減輕MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　本實驗旨在探討Sal是否能通過調(diào)節(jié)MEF2D-ND6通路防止線粒體復(fù)合體I

6、損傷以保護(hù)DA能神經(jīng)元，為臨床開發(fā)治療PD的新藥提供實驗依據(jù)。
　　第一部分 Sal對MPP+-PD細(xì)胞模型的保護(hù)作用
　　目的：建立MPP+-PD細(xì)胞模型，探討Sal是否在體外減少M(fèi)PP+誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。方法：分組處理后，MTT檢測細(xì)胞活性，乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase, LDH）細(xì)胞毒性檢測試劑盒檢測細(xì)胞毒性，DHE測定超氧化物陰離子（O2—）水平，DCFH-DA測定ROS水平， MitoTra

7、cker測定線粒體形態(tài)水平，TMRE測定線粒體膜電位（ΔΨm）水平，線粒體復(fù)合體I活性檢測試劑盒檢測線粒體復(fù)合體I活性。結(jié)果：MTT檢測發(fā)現(xiàn)，不同濃度Sal處理對SN4741細(xì)胞活性沒有顯著影響（P>0.05），50μM MPP+處理24 h（MPP+組）則使細(xì)胞活性下降至IC50水平（P<0.01），Sal+MPP+組可以顯著保護(hù)細(xì)胞活性至86.7±9.5％（P<0.01）。TUNEL和Annexin V-FITC/PI檢測發(fā)現(xiàn)，Sa

8、l組不增加細(xì)胞凋亡率（P>0.05），MPP+組可使細(xì)胞凋亡率增加（P<0.01），而Sal+MPP+組中Sal預(yù)處理后細(xì)胞凋亡率減少（P<0.01）。LDH檢測發(fā)現(xiàn)，Sal組不增加細(xì)胞毒性（P>0.05），MPP+組可使細(xì)胞毒性增加（P<0.01），而Sal+MPP+組則可使細(xì)胞毒性減少（P<0.01）。O2—和ROS檢測發(fā)現(xiàn)，Sal組不增加O2—或ROS水平（P>0.05），MPP+組可使O2—或ROS水平顯著增加（P<0.01），

9、而Sal+MPP+組則可使O2—或ROS水平減少（P<0.01）。MitoTracker檢測發(fā)現(xiàn)，Sal組對線粒體的長度無影響（P>0.05），MPP+組可使線粒體碎片化，其長度比例降低（P<0.01），而Sal+MPP+組可使線粒體碎片化減少，長度比例增加（P<0.01）。ΔΨm檢測發(fā)現(xiàn)，Sal組對ΔΨm無影響（P>0.05），MPP+組可導(dǎo)致ΔΨm減少（P<0.01），而Sal+MPP+組可使ΔΨm增加（P<0.01）。線粒體復(fù)合體

10、I活性檢測發(fā)現(xiàn)，Sal組對其活性無影響（P>0.05），MPP+組可使其活性減少（P<0.01），而Sal+MPP+組則可使其活性增加（P<0.01）。結(jié)論：Sal在MPP+-PD細(xì)胞模型中不僅可以提高細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞凋亡，而且可以穩(wěn)定線粒體形態(tài)和功能，并且具有抗氧化作用。
　　第二部分 Sal對MPP+-PD細(xì)胞模型中MEF2D-ND6通路的保護(hù)作用
　　目的：建立MPP+-PD細(xì)胞模型，探討Sal是否在體外可以調(diào)節(jié)ME

11、F2D-ND6通路。方法：采用熒光素酶報告基因檢測MEF2D的轉(zhuǎn)錄水平，Westerning Blot方法檢測MEF2D和ND6蛋白水平及細(xì)胞質(zhì)、線粒體和細(xì)胞核中MEF2D蛋白水平，qPCR檢測MEF2D和ND6 mRNA水平，免疫熒光檢測MEF2D和線粒體的共定位水平。結(jié)果：熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)，Sal處理后MEF2D的轉(zhuǎn)錄活性未增加（P>0.05），MPP+處理后MEF2D的轉(zhuǎn)錄活性顯著降低（P<0.01），而Sal+MPP+組

12、MEF2D的轉(zhuǎn)錄活性顯著增加（P<0.01）。Westerning Blot檢測發(fā)現(xiàn)，Sal處理后MEF2D蛋白水平亦無顯著變化（P>0.05），MPP+組中MEF2D蛋白水平下降（P<0.01），Sal+MPP+組可保護(hù)MEF2D蛋白水平使其增加（P<0.01）。qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，Sal組中MEF2D mRNA無顯著改變（P>0.05），MPP+組中MEF2D mRNA水平下降（P<0.01），而Sal+MPP+組可保護(hù)MEF2D m

13、RNA水平使其增加（P<0.01）。免疫熒光染色和Westerning Blot檢測細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和線粒體分離顯示，Sal組對細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和線粒體的MEF2D蛋白水平無顯著改變（P>0.05），MPP+組處理后細(xì)胞質(zhì)、線粒體和細(xì)胞核中MEF2D蛋白下降均較為顯著（P<0.01），而Sal+MPP+組則細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和線粒體中的MEF2D蛋白水平均顯著升高（P<0.01）。Westerning Blot檢測發(fā)現(xiàn)，Sal組中ND6蛋白水平

14、無顯著變化（P>0.05），MPP+組中ND6蛋白水平顯著下降（P<0.01），而Sal+MPP+組可保護(hù)ND6蛋白水平使其增加（P<0.01），但是與正常對照組比較差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，Sal組中ND6 mRNA水平無顯著變化（P>0.05），MPP+組中ND6 mRNA水平下降（P<0.01），而Sal+MPP+組中ND6 mRNA水平則顯著增加至2.11±0.37倍，并與MPP+組和正常對照組比較差

15、異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論：Sal在MPP+-PD細(xì)胞模型中可保護(hù)MEF2D-ND6通路以抵抗MPP+的神經(jīng)毒性。
　　第三部分shMEF2D和Mt2Ddn后Sal對MPP+-PD細(xì)胞模型的影響
　　目的：建立shMEF2D和Mt2Ddn模型，觀察Sal對MPP+-PD細(xì)胞模型的影響。方法：采用MTT觀察細(xì)胞活性，Westerning Blot方法檢測MEF2D和ND6蛋白變化水平，MitoTracker測定線粒

16、體形態(tài)，線粒體復(fù)合體I活性檢測試劑盒檢測線粒體復(fù)合體 I活性。結(jié)果：shMEF2D轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活性與對照組無顯著差異（P>0.05）。shMEF2D+MPP+組中shMEF2D轉(zhuǎn)染后可顯著增加SN4741細(xì)胞對MPP+的敏感性，MPP+僅處理12 h則表現(xiàn)為細(xì)胞活性降低，MEF2D和 ND6蛋白水平下降，線粒體長度減少，線粒體復(fù)合體I活性降低（P<0.01）。shMEF2D+Sal+MPP+組中shMEF2D轉(zhuǎn)染后Sal預(yù)處理24 h亦不

17、能保護(hù)細(xì)胞活性、MEF2D和ND6蛋白水平、線粒體長度和線粒體復(fù)合體I活性，與 shMEF2D+MPP+組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。單純轉(zhuǎn)染 Mt2Ddn后，即將ND6上的MEF2D結(jié)合位點阻斷后細(xì)胞活性即顯著下降，而且MEF2D和ND6蛋白水平均顯著下降、線粒體長度縮短和線粒體復(fù)合體I活性減少（P<0.01）。而Mt2Ddn+Sal組中經(jīng)Sal處理4 h后細(xì)胞活性、MEF2D和ND6蛋白水平、線粒體長度和線粒體復(fù)合體 I活

18、性均無顯著恢復(fù)，與 Mt2Ddn組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：Sal可能通過MEF2D-ND6通路在MPP+-PD細(xì)胞模型中發(fā)揮保護(hù)SN4741細(xì)胞作用。
　　第四部分 Sal對MPTP-PD小鼠模型中MEF2D-ND6通路的保護(hù)作用
　　目的：建立MPTP-PD小鼠模型，探討Sal是否在體內(nèi)通過調(diào)節(jié)MEF2D-ND6通路發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。方法：隨機(jī)將40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。爬桿實驗用于檢測小鼠

19、的肢體運(yùn)動協(xié)調(diào)情況，曠場實驗評價小鼠的運(yùn)動能力的變化，免疫熒光染色方法觀察SNpc的TH陽性神經(jīng)元數(shù)量，Western Blot檢測MEF2D和ND6蛋白水平，線粒體復(fù)合體I活性檢測試劑盒檢測線粒體復(fù)合體I活性。結(jié)果：爬桿實驗中，Sal組小鼠完全調(diào)轉(zhuǎn)頭的時間（T-turn）和爬到地面的時間（T-LA）時間無顯著變化（P>0.05）， MPTP組T-turn和T-LA時間均顯著增加（P＜0.01），而Sal+MPTP組可以顯著減少T-tu

20、rn和 T-LA時間（P＜0.01）。曠場實驗中，Sal組小鼠運(yùn)動頻率和靜止時間無顯著變化（P>0.05），MPTP組運(yùn)動頻率顯著降低，而靜止時間增加（P＜0.01），而 Sal+MPTP組可以顯著恢復(fù)運(yùn)動頻率，并且減少靜止時間（P＜0.01）。免疫熒光檢測顯示，Sal組TH陽性神經(jīng)元數(shù)量無顯著變化（P>0.05），MPTP組其數(shù)量則顯著下降（P＜0.01）；而Sal+MPTP組可以保護(hù)其數(shù)量使其增加（P＜0.01）。而且，Sal組ME

21、F2D和ND6蛋白水平均無顯著變化（P>0.05），MPTP組MEF2D和ND6蛋白水平均顯著下降（P＜0.01）， Sal+MPTP組可以保護(hù)MEF2D和ND6蛋白使其增加（P＜0.01）。線粒體復(fù)合體I活性檢測發(fā)現(xiàn)，Sal組線粒體復(fù)合體I活性無顯著變化（P>0.05），MPTP組其活性顯著下降（P＜0.01），而Sal+MPTP組可以保護(hù)其活性使其增加（P＜0.01）。結(jié)論：Sal在MPTP-PD小鼠模型中可保護(hù)MEF2D-ND6通